生物樣品中唾液酸和神經節苷脂的測定

高 靜

（青島科技大學化工學院，山東 青島 266042）

0 介紹

神經節苷脂是一類含有唾液酸的酸性鞘糖脂，是神經細胞膜的重要組成成分，結構中含有一種或多種成分的唾液酸，更確切的說，神經節苷脂是由鞘氨基醇與脂肪酸相結合，然后通過酰胺鍵連接到包含一種或多種唾液酸的低聚糖鏈上［1］。在物理條件下，唾液酸分子中含有一個負電荷，通常以低聚糖，糖脂或糖蛋白的形式存在。近年來，隨著對細胞膜表面糖類生理功能研究的日益重視，神經節苷脂的研究也日趨受到科學界的關注，特別是隨著神經生物化學和神經藥理學的發展，對神經節苷脂的代謝及其生物學作用研究已經成為神經科學的重要課題［2］。神經節苷脂在國內大多數依賴進口，雖然國內外已報道了多種分離純化的方法，但大多都有操作步驟繁瑣、溶劑用量大等不足之處。目前國內外的研究主要集中于其與生物膜其他有效成分之間的相互作用，而對神經節苷脂的分離方法的最佳選擇未給予詳細的報道。因此，本文就多種分離純化方法做一下比較總結，對其分離過程起到一定的幫助。

1 唾液酸

唾液酸的分析從它們釋放時開始，將樣品純化后用不同技術進行分析，下面就對不同分析檢測方法做一下介紹。

1.1 樣品制備

1.1.1 唾液酸的提取方式

一般使用兩種方式處理：酸水解及固定化酶處理。

酸水解是應用最廣泛的處理方法。用恒溫箱或者加熱器將反應保持在加熱條件下（70℃～90℃）。最常用的酸是硫酸濃度為25～100mmol的酸溶液［4］。其他研究者曾經將不同的試劑用于水解，如稀釋的鹽酸、微波處理的乙酸、次硫酸鈉或者三氟醋酸，這些都可以減少水解時間。

對于不同的酸水解都要做對照實驗（25mmol HCl，25mmol三氟醋酸TFA，25mmol H2SO4）。用鹽酸或TFA水解是最好的選擇，雖然經過2h的水解會損失20％左右［5］，但是操作簡便。通過從微生物中獲得的神經氨酸酶對唾液酸進行水解時損失最小，但控制生物樣品的反應并不容易，因為它的釋放依賴于組織結構以及酶的來源情況。

酶法處理效果比水解的效果要差，因為并不能提取所有非游離唾液酸。相反，酸水解能夠提取所有非游離唾液酸，但是可能會對一部分造成破壞，并且能夠參與后面的反應過程，各有利弊。

經過實驗比較，考慮到酶的成本及實際的反應效果，我們認為不管是采用色析法還是色度法，酸水解都是最常用的處理方法，因為這種方法重現性好，容易操作且成本相對較少。

1.1.2 純化

對于早前的硅酸鹽測定，陰離子交換柱是純化試樣的最常用的選擇。其他的純化方法還有固體萃取如SepPak C18柱［6］，或者對樣品進行超速離心，一般在水解后用于消除雜蛋白。另外一種可能是將陰離子交換柱與超速離心聯合應用對樣品進行處理，陰離子交換柱是最有效的提純方法，但同時也是繁瑣且耗費大的方法。因此，只有當樣品非常復雜的時候才使用這種方法。相反，SPE柱可以對樣品進行快速簡便的分離純化，但只有在干擾因素很小的條件下才適用，因此推薦在純化樣本后使用［7］。

1.2 唾液酸的測定

1.2.1 分光光度法

考慮到唾液酸的結構與糖類似，因此將分光光度法作為測定唾液酸的專用技術。但是采用這種方法的缺點是選擇性比較差，如果沒有之前的純化步驟就不能用此法測定，而且不能用其區別不同結構的唾液酸。測定唾液酸基本上要用到三種比色法：間苯二酚法，丙二酰硫脲測定法及酶測定法［8］。

應用最廣泛的分光光度法是由Svennerholm發明的［9］，后人對這種方法又做了一定的修正，即用陰離子交換法來提高純度。采用這種方法時在蔗糖與間苯二酚之間發生反應。由于唾液酸是糖脂類神經節苷酯物質所含有的特征基團，因此當與間苯二酚反應生成紫色復合物可用于神經節苷脂的含量測定。本法主要用于人體組織和生物體液的檢測，但一些研究者已經將其用于乳制品檢測當中，如牛奶制品和嬰兒奶粉的檢測。

1.2.2 液相色譜法

液相色譜法也是測定唾液酸較常用的方法，當樣品沒有被衍生化的時候，最常用的方法就是紫外檢測離子對的方法。這種方法最初是由Spyridiaki與Siskos聯合研究出來的［10］，他們通過實驗模擬提高了以下物質檢測時的溶出度，包括Neu5Ac，Neu5Gc，N-乙?；?9-O-乙酰神經氨酸等。在分析中使用了多種親脂的陽性離子對，如四辛基溴化銨（TOA-Br）三異丙醇胺（TIP），或者三乙醇胺（TEA）等。使用時一般選用TIP，因為它的強度和分離度更好，但在操作中必須要注意pH的控制，（最佳值為3.5），這是決定因素。但是實驗發現，當這種方法應用到血清、尿液、唾液當中時，只能區分兩種形式的唾液酸（Neu5Ac and Neu5Ac2en）［11］，在純化步驟中必須除去蛋白質。由于其限制條件較多，因此在分析結構較多的唾液酸混合物時不推薦使用本方法。

1.2.3 氣相色譜法

氣相色譜法（GC）與質譜法聯用起初是用來鑒定苷脂鍵及衍生反應后的氧代神經氨酸，Zanetta等人在此基礎上研究了一種非常有效的方法，用來測定唾液酸標準液及生物體液如馬血清及牛、羊、馬的下顎下腺粘蛋白等［12］。這種方法是在無水甲醇和使用七氟酸酐形成的揮發性衍生物存在的前提下，通過重氮甲烷酐的甲基酯化進行氣相色譜/質譜電子轟擊的。這種方法能夠區分大部分的唾液酸，包括O-?；腘eu5Ac，Neu5Gc和8-O-鄰甲基和8-O-硫酸衍生物以及1，7-唾液酸內酯。在后面的研究中，這個研究小組對本方法做了小的修改，從而對單糖、脂肪酸和氨基酸在人的粘蛋白和尿素當中可以更好定位。樣品仍可以用相同的反應容器，并按照分析唾液酸的方法用GC/質譜進行分析。相對于上面的方法，本法的測定范圍更加全面，其應用前景也更加廣泛。

1.2.4 電遷移方法

這種技術，尤其是毛細管區帶電泳技術（CZE），是應用最廣泛的分析檢測糖類結構的方法之一［13］。因此當對唾液酸進行測定時也很容易操作。在最近的研究中，Ortner與Buchberger發展了一種簡便、快捷并且重現性很好的方法來檢測人血清和標準糖蛋白中的Neu5Ac和Neu5Gc［14］，這種方法是CZEMS（質譜），本法用對乙酰氨基酚作為內標物。CZE和MS的連用檢測能夠在排除基質干擾的條件下定量分析化合物，線性范圍保持在10～100μg/mL內，同時LOD值為2μg/mL。

2 神經節苷脂

2.1 提取、分離、及純化神經節苷脂

在動物組織中，最初以及最常用的的提取分離純化方法是由Folch等人研究的［15］。第一步是使用不同比例的氯仿和甲醇提取總脂成分。第二步，將神經節苷脂從此成分中分離純化出來，利用鹽在水相中的分配比不同提取。這些基本的方法隨著發展已經發生了一些變化，但最終目標都是為了提高目標產物的含量。

2.2 神經節苷脂的測定

總神經節苷脂量可以通過分離純化唾液酸內容物來定量，量化結果可以用脂鍵聯合唾液酸的方式表達。

不管總神經節苷脂的鑒別還是定量都需要一種有效的分離方法，主要的方法有薄層色譜法（TLC），高效薄層色譜法（HPTLC）以及層色譜法（LC）［16］。

2.2.1 薄層色譜/高效薄層色譜

薄層色譜法屬于傳統技術，受到廣泛應用。目前，高效薄層色譜法使用的是二氧化硅60，能提供高分辨率來分離神經節苷脂。不使用以往常用的塑料和玻璃板塊是因為間苯二酚-HCl常會對板塊染色，而鋁塊是因其不能抵抗酸的腐蝕。對于樣品的應用，脂類結合的唾液酸推薦量是5～10μg。

關于顯影劑，總混合物的比例為CHCl3：MetOH：0.2％CaCl2（55：45：5，v/v/v）［17］，在此比例下能夠表現良好的重現性，且能夠分離出最重要的神經節苷脂（GM3and GD3），甚至能在其脂肪酸和鞘氨基醇堿基組成的基礎上分離同種神經節苷脂。

2.2.1.1 經典測定方法

歷史上，第一次用于染色的試劑是地衣酚，因為它能與糖的反應連接脂類，稱粉甲紫染色法。其缺點是對神經節苷脂不具有專一性。斯文納霍爾姆通過采用間苯二酚檢測，在100℃下反應15min后，顏色變成了藍紫色，中性和硫化的神經節苷脂則變成黃棕色，可以說這是最有效和敏感的檢測試劑［18］。神經節苷脂可以通過與牛腦或其他物種或組織的標準樣對照從而得到鑒定。為了準確觀察樣品板是否被顯色試劑染色，需要用到光密度計，可將光密度計波長設為580nm進行測定。這種方法可重復操作，用于簡單快速的測定動物組織中的神經節苷脂，甚至被用來確定細胞系和在樣品中GM3和GD3以及GT3的神經節苷脂（GM1，GM2，GM3，GD1a，GD1b和GT1b）。另一種可能性是通過計算機輔助，在二維高效液相色譜處理后對密度進行成像，通過圖像分析儀處理間苯二酚染色板和用計算機軟件處理，允許測定GM3，GM1a，GD1a的線性在（r＞0.99）0.01nmol和5nmol之間［19］。光密度測定方法比電腦成像密度方法更加靈敏和精確。

2.2.1.2 質譜分析測定

質譜（MS）能夠利用薄層色譜與高效液相色譜板來鑒別及定量神經節苷脂，雖然這種方法的靈敏性較TLC/HPTLC免疫染色法低，但這兩種方法都可以作為薄層掃描法測定神經節苷脂的補充方法。薄層色譜法與快原子轟擊（FAB）及質譜連用的優點歸因于FAB-MS與氣相、液相及超臨界流體色譜儀是從生物反應表面得出結果的最有效方法［20］。TLCFAB-MS連用效率高且省時，但條件是仍然需要大分子的解吸附來增加靈敏度，并盡量減少基質中離子源的污染。因此，這種方法對樣本的要求很高，在實際的應用中也會受到一定的限制。

2.2.2 液相色譜法與質譜法聯用

近幾年，一項液相色譜法與質譜法連用的技術逐步發展起來，實驗證明，這種方法能夠用于牛奶及嬰兒配方中的神經節苷脂中GD3和GM3的測定。其GD3與GM3的重現性分別小于5％和14％，其覆蓋范圍在83％～87％［21］。由于本法的重現性比較低，所以不建議直接應用，在進一步研究及改進之后，相信本方法會成為一種可靠的分析方法應用到實際操作中去。

3 結論

分光光度法不僅可以將生物試樣中的唾液酸進行定量分析，還可以將總神經節苷脂量進行分析測定，因此現在仍然是主要的分析方法。其應用方式主要為脂類與唾液酸的聯合應用。而色譜技術能夠將兩種主要結構的唾液酸進行區分，這種方法不僅可以測定樣品的原始數據還可以檢測在臨床環境中唾液酸代謝情況的變化（如癌癥的早期診斷）［22］。

神經節苷脂在生物試樣中的檢測都需要一系列冗長的準備工作，如提取、分離以及純化工作，但這又是最關鍵性的操作步驟，因為這些步驟可以從根本上反應出實際的損耗，要將所有干擾源消除非常困難，只能盡量減少。所以在分析過程中，一定要認真將此前期工作認真準備。

TLC/HPTLC仍然是分離神經節苷脂的重要方法。在所有方法當中，免疫染色法是鑒別神經節苷脂的最有效技術，而分光光度法可以實現定量。但后者由于具有專一性，因此具有更高的靈敏度和容量來得到結構信息，在實驗操作中也應用的更加廣泛。

神經節苷脂測定的未來趨勢是利用質譜分析來闡釋所有結構的神經節苷脂、糖鏈、脂肪酸以及鞘氨基醇，并且調節他們的生物活性。本文對多種分析方法做了分析與比較，為神經節苷脂的開發利用提供了理論和一定的實驗依據，這就是分析所有鑒別方法的意義所在。

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