機械牽拉誘導骨骼肌衛星細胞激活的分子機制研究進展

陳濤 王海燕 陳彩珍 盧健

青少年健康評價與運動干預教育部重點實驗室，華東師范大學體育與健康學院（上海 200241）

了解衛星細胞激活過程中的控制因素，有利于設計出更好的促進骨骼肌發育和修復方案，以應用到運動科學（提高運動員機能表現）和健康科學（特別是肌肉萎縮和Sarcopenia的治療方法）領域。

1 骨骼肌衛星細胞的激活

衛星細胞的激活是提供新的肌細胞核（融合成新的肌纖維或當前肌纖維肥大）的第一步，骨骼肌發育、損傷修復的過程中同樣需要衛星細胞的激活。在成體骨骼肌中，處于靜息狀態的衛星細胞只在適當的條件（損傷、運動刺激、牽拉或去神經）下被激活（進入細胞周期）［1］。激活的衛星細胞移位到損傷位點，進行DNA復制，增殖、分化融合到肌纖維上或形成新的肌纖維，通過這種途徑，肌細胞核增加，也為骨骼肌肥大奠定基礎。

衛星細胞的激活過程伴隨著復雜的生物學調節機制，衛星細胞的活化、增殖和成肌分化是由細胞連接、細胞與細胞外間質的相互作用及生長因子決定的，如胰島素樣生長因子1（IGF-1）、成纖維細胞生長因子（GFF）、肝細胞生長因子（HGF）、一氧化氮（NO）在肌衛星細胞激活中的信號作用已被很多研究證實［2］。

目前國內學者多采用體外細胞培養技術研究衛星細胞的增殖和分化能力，已取得顯著成果。例如，路睿睿等［3］采用脂多糖刺激體外培養的骨骼肌衛星細胞，觀察肌衛星細胞產生肝細胞生長因子及肌衛星細胞增殖分化的變化，發現脂多糖可誘導肌衛星細胞自分泌肝細胞生長因子，并促進肌衛星細胞增殖分化。邵素霞等［4］研究發現肝細胞生長因子對骨骼肌衛星細胞具有較強的促增殖作用。

國外學者則多從分子水平的信號轉導通路入手，研究HGF等生長因子對肌衛星細胞的生物學調節機制。NO-HGF-c-met通路被認為是衛星細胞激活過程中非常重要的一條信號通路，因為在眾多的生長因子中，HGF是唯一一個能把安靜狀態下的衛星細胞激活并促進其進入細胞周期的生長因子［5，6］。

2 骨骼肌衛星細胞激活過程中的關鍵因子

2.1 HGF

HGF因對肝細胞具有很強的絲裂原作用而被命名為肝細胞生長因子［7］。1987年，Stoker等［8］發現成纖維細胞分泌一種能促進上皮細胞集落擴散的細胞因子，稱為離散因子（SF），后來研究發現SF即HGF［9］，隨著研究的深入，發現HGF/SF作為一種多效能的細胞因子，在許多細胞和組織中發揮促細胞發育和分化的作用。HGF/SF的信號作用是由原癌基因c-met編碼的跨膜受體蛋白所介導的［10］。Jennische［11］等在再生的骨骼肌中檢測到 HGF mRNA，第一個將HGF與骨骼肌聯系起來。而后Tatsumi等［5］在安靜和激活狀態下的骨骼肌衛星細胞膜上均發現了HGF及其受體c-met。轉基因小鼠過度表達HGF會導致骨骼肌異位發育，提示HGF在骨骼肌發育的過程中具有生理上的分散作用［12］。此外，Bladt等發現c-met突變小鼠不能形成正常的骨骼肌群［13］。1995年Allen等發現HGF激活大鼠離體骨骼肌衛星細胞，促使其進入細胞周期［6］。1998年Tatsumi也證實在大鼠骨骼肌中，HGF通過其受體c-met能激活衛星細胞［5］。此后一系列包括對培養離體肌原細胞、單根肌纖維及活體骨骼肌的研究均證實HGF通過與衛星細胞膜上的c-met結合激活衛星細胞［14，15］。一般情況下，HGF位于肌細胞外區域，有可能與細胞外基質主要組成部分——蛋白聚糖連接在一起，當骨骼肌損傷時，HGF能快速從細胞外基質釋放出來并與衛星細胞膜上的 c-met結合，激活衛星細胞［5，16］。

2.2 NO

內源性NO是在一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和還原型尼克酰胺嘌呤二核苷酸（ANPDH）的共同作用下，利用L-Arg和活性分子氧生成的。NOS在多種細胞中均有表達，目前已確定有3種NOS同工酶，分別是神經原型（neuronal-NOS，nNOS）、內皮型（endothelial-NOS，eNOS）和誘導型（inducible-NOS，iNOS）［17］。骨骼肌中主要表達nNOS，Ⅰ型和Ⅱ型肌纖維中均有nNOS表達，nNOS通過與抗肌萎縮蛋白-糖蛋白復合體結合分布在骨骼肌細胞膜上［18］。正常情況下，骨骼肌中的NO處于非常低的水平，衛星細胞也處于安靜狀態，在運動訓練、負重、損傷、剪切應力或機械牽拉的刺激下，NOS的表達或活性增加［19］。2000 年 Anderson［15］研究證實擠壓損傷的骨骼肌中，NO的快速釋放是誘導衛星細胞肥大并脫離其毗鄰衛星細胞的關鍵。2002年Anderson等［16］又通過離體培養單根肌纖維發現，NO可以激活安靜狀態下的衛星細胞，阻斷NO的合成，也阻斷了衛星細胞的激活。

3 機械牽拉刺激骨骼肌衛星細胞激活的信號通路

3.1 HGF與骨骼肌衛星細胞激活

Tatsumi等［20］采用細胞培養技術，利用真空負壓牽拉刺激，從9月齡SD大鼠骨骼肌中分離出安靜狀態下的衛星細胞，牽拉刺激12、24、48小時后發現，激活狀態的衛星細胞數量顯著增加，與HGF激活離體大鼠骨骼肌衛星細胞的情況一致［20，21］，使用HGF阻滯劑可以降低機械牽拉誘導的衛星細胞激活的數量。其后發現2小時的牽拉即可誘導衛星細胞的激活，且抑制HGF的活性，發現衛星細胞的激活數量明顯減少，幾乎與對照組無差異。對牽拉2小時組培養基進行免疫印跡檢測，發現具有活性的HGF，并且其能夠激活未牽拉組衛星細胞。為了確定HGF的來源及HGF是否定位在c-met呈陽性的衛星細胞上，Tatsumi［20］等又使用了免疫熒光雙標記技術，結果證實HGF主要集中在細胞膜表面。使用1.0M濃度的NaCl洗滌牽拉12小時組的衛星細胞以去除細胞外的HGF，牽拉誘導的激活作用消失，繼續牽拉刺激該組發現，衛星細胞依然可被內源性的HGF激活。這些研究為牽拉刺激誘導的衛星細胞激活作用是通過細胞外基質HGF釋放實現的提供了有力的證據。

3.2 NO與骨骼肌衛星細胞激活

為了研究NO在HGF釋放過程中的作用，Tatsumi等［21，22］通過添加NOS抑制劑 （L-NAME），發現牽拉刺激衛星細胞的激活作用消失，增加HGF可以使這種激活作用得到恢復，說明L-NAME并非直接抑制衛星細胞的激活，而是通過抑制HGF從而抑制衛星細胞的激活。用免疫印跡法檢測該組培養基，發現HGF并未釋放出來。此外，給非牽拉組添加亞硝基五氰絡鐵酸鈉二水化合物（一種NO供體），發現衛星細胞激活的速度增加，用免疫印跡法檢測培養基，也能檢測出HGF。這些結果表明，機械牽拉作用誘導的HGF從其細胞外基質儲存庫中的釋放依賴NO的生成［22］。

3.3 MMP與骨骼肌衛星細胞激活

2006年，Yamada等［23］發現基質金屬酶蛋白（MMPs）介導了NO誘導的HGF釋放。MMPs的活性受到抑制的情況下，可阻斷HGF的釋放和后繼的衛星細胞的激活。MMPs是一個鋅依賴的肽鏈內切酶大家族，目前已明確其有25個家族成員，均有一個前肽區和一個包含鋅離子的催化區域。作為肽鏈內切酶，其家族成員可以降解數種細胞外基質蛋白，如膠原蛋白、彈力蛋白、纖維結合蛋白、蛋白聚糖等［24］。MMP-2、3、7和9在骨骼肌中均有表達［25，26］，其中 MMP2、3、9 可以裂解硫酸類肝素蛋白多糖的核心蛋白，這些金屬蛋白酶可能通過調節細胞外基質的完整和組成，在骨骼肌發育和修復過程中發揮重要作用［25］。NO可直接亞硝基化MMP，調節其活性。此外，有相關研究發現，NO可上調MMP-2和MMP-9的蛋白表達水平和酶活性。2008年，Yamada等［26］在對離體培養的大鼠骨骼肌衛星細胞施以30μM亞硝基鐵氰化鈉（一種NO供體）或機械牽拉2小時的過程中，發現非活性的MMP-2前體（72 kDa）轉變成了成熟體（52 kDa），在加入NOS抑制劑L-NAME 10μM后，這種轉變同樣被抑制。在非牽拉組中，添加1μMNOC-7（可以自發生成NO），發現重組的MMP-2蛋白轉化為成熟體MMP-2（52 kDa），免疫印跡檢測該組培養基發現HGF。因此可以推測NO激活的MMP2也許介導了HGF從細胞外基質中的釋放，從而激活衛星細胞。

2009年，Tatsumi［27］等發現鈣 -鈣調蛋白同樣可以誘導HGF的釋放并激活衛星細胞，并且可能在NO合成過程中起到一種信號作用。在體外培養的衛星細胞培養基中添加鈣離子載體，2小時后HGF釋放并激活衛星細胞，這種效果與機械牽拉或添加NO供體一樣。添加鈣調蛋白抑制劑可以消除這種激活作用。該研究結果提示，可能是鈣-鈣調蛋白通過激活NO的合成介導了細胞外基質釋放HGF，從而激活衛星細胞。

綜合以上一系列研究，可將NO依賴的衛星細胞激活信號通路歸納如下，即衛星細胞激活的分子機制是一系列分子級聯應答反應的結果，包括鈣-鈣調蛋白的形成、NOS的激活、NO的生成、MMP的激活、HGF的釋放、HGF與其受體c-met的結合等。

4 總結

衛星細胞是出生后骨骼肌中固有的、具有增殖分化潛能的肌源性干細胞，大部分處于靜息狀態。當骨骼肌受到損傷、運動刺激或機械牽拉時，衛星細胞被激活，進而增殖、分化，融合到臨近的肌纖維上，以促進受損肌纖維修復再生或運動誘導的骨骼肌肥大。目前的研究結果表明，機械刺激觸發的一系列級聯反應需要NO-MMP2-HGF-c-met的參與，這可能就是骨骼肌將機械變化轉化為化學信號從而激活衛星細胞的分子機制。當然，調節衛星細胞機能的信號通路還有很多，錯綜復雜，因此需要對“機械-生物學”在骨骼肌衛星細胞激活過程中的作用和機制進行深入研究和理解。

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