毛細管電泳在蛋白多肽藥物分析中的應用

于曉芳，張忠平

(山東誠創(chuàng)醫(yī)藥技術開發(fā)有限公司，山東 濟南 250101)

蛋白多肽藥物是一類具有生物活性的大分子物質，尋求準確、靈敏、高效和簡便的分析方法研究這類物質一直是藥物分析者的研究重點。毛細管電泳(Capillary Electrophoresis，CE)又稱高效毛細管電泳，被譽為是20世紀90年代最為重要的分離分析方法之一，已成為某些藥品質量標準中常規(guī)的分析方法。近年來它在生物大分子(尤其是蛋白多肽)的分離分析和應用研究方面已經取得了長足的進展，各種分離模式和檢測技術的應用、柱上富集技術以及與其它方法的聯(lián)用技術，使毛細管電泳法在研究復雜體系或痕量組分方面成為強有力的分析手段。

近10年來，國內外有關毛細管電泳技術的文獻相繼發(fā)表，毛細管電泳的研究呈明顯上升趨勢，其中，蛋白多肽的研究占有較大比重。本文綜述了毛細管電泳在蛋白多肽藥物分析中的應用。

1 毛細管電泳

毛細管電泳是以毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，依據樣品中各組分在毛細管中分配行為和淌度的差異而進行高效、快速分離的一種新型的液相分離分析技術。

1.1 毛細管電泳的類型 為了適應不同分析對象的要求，分析科學家已經開發(fā)出多種毛細管電泳分離模式，使毛細管電泳技術不斷趨于完善和成熟，它們各具特色，成為毛細管電泳技術重要組成部分。主要包括毛細管區(qū)帶電泳(CZE)、毛細管膠束電動色譜(MEKC)、毛細管凝膠電泳(CGE)、毛細管等電聚焦電泳(CIEF)、毛細管等速電泳(CITP)、毛細管電色譜(CEC)、親和毛細管電泳(ACE)、非水毛細管電泳(NACE)、芯片毛細管電泳(MCCE)、毛細管陣列電泳(CAE)等。

1.2 毛細管電泳的特點 毛細管電泳技術兼有高壓電泳及高效液相色譜的優(yōu)點，其突出特點表現在以下幾個方面:所需樣品量少、儀器自動化程度高、操作簡便;分析速度快，分離效率高，分辨率高;操作模式多，開發(fā)分析方法容易;實驗成本低，消耗少，應用范圍極廣;另外毛細管電泳彌補了HPLC在低波長下定量測定的不足。

毛細管電泳也存在不足之處。首先它不能像HPLC一樣可用于制備分離。其次無論哪種分離模式都存在毛細管對蛋白質的吸附所導致的電泳遷移時間重現性差和精密度不高等問題，由進樣量精密度不高導致的峰面積大小不穩(wěn)定和定量不準確等問題。

1.3 毛細管電泳的發(fā)展方向 目前，毛細管電泳的發(fā)展方向主要有兩個方面。第一是毛細管電泳的應用研究，主要集中在蛋白質、多肽分離、DNA測定、手性分離、糖型分析等分析領域。由于毛細管電泳在結構相似的蛋白質、多肽分離中顯示了獨特優(yōu)勢，目前在這一領域的研究十分活躍。第二是毛細管電泳方法本身的完善和儀器發(fā)展，主要以建立新的分離模式、聯(lián)用技術以及克服自身方法不足為重點。重現性、速度和檢測靈敏度的提高，將使越來越多的制藥企業(yè)開始使用毛細管電泳，而不是僅停留在基礎研究階段。

2 毛細管電泳在蛋白多肽藥物分析中的應用

蛋白多肽的分離分析是CE技術最早的應用之一。1981年Jorgenson和Lukacs［1］使用75 μm毛細管進行區(qū)帶電泳分析丹酰化氨基酸時，發(fā)現毛細管的分離柱效與電場強度成正比(N∝E)，與溶質分子的擴散系數成反比(N∝D－1)，而蛋白質和多肽具有擴散系數小的特點，因此理論上毛細管電泳非常適合于蛋白質和多肽等生物大分子的分析研究。

2.1 蛋白多肽藥物的分離研究 毛細管電泳對蛋白多肽藥物的分離尤其是結構相似的蛋白多肽藥物的分離是對其進行分析研究的基礎。CE分離原理不同于HPLC，它是依據樣品中各組分在毛細管中分配行為和淌度的差異而進行分離，分離效率高，在蛋白多肽藥物分離中顯示出獨特的優(yōu)勢。

Wielgos和 Somsen 等［2，3］分別采用了高濃度的緩沖液(600 mM 的磷酸鹽pH3.5，850 mM 的Tris緩沖液pH 3.0)以及25 μm內徑的毛細管柱，將肝素鈉和多硫酸軟骨素和硫酸皮膚素分離。目前國內采用的方法只能將前兩者分離，并且分離度不高，用于鑒別肝素鈉中是否含有多硫酸軟骨素;另外有文獻報道采用CZE法分析抑肽酶中去丙氨酸－抑肽酶(抑肽酶C端脫去一個丙氨酸)和去丙氨酸－去甘氨酸－抑肽酶(抑肽酶C端脫去一個丙氨酸和一個甘氨酸)，它們相對與抑肽酶的保留時間僅為0.98和0.99，這樣小的差異在HPLC上幾乎不可能達分離。

2.2 蛋白多肽藥物的純度鑒定 對蛋白多肽藥物的純度鑒定是毛細管電泳法的又一應用。由于生物藥品所特有的復雜性和質量要求的嚴格性，其純度鑒定需要更加強有力的分析手段。常用的純度鑒定方法有凝膠電泳和HPLC法，但是CE具有更高的分辨率和靈敏度，上樣量更少，僅為納升級，非常適合于珍貴的蛋白質樣品的分析。

Pessi等［4］研究發(fā)現，純化的多抗原肽在凝膠電泳和HPLC上純度為100%，但是在HPCE分析時純度僅為90%;Catai等［5］采用雙涂層毛細管柱分析重組人生長激素(hGH)的純度，將hGH與其脫氨產物、剪切產物、18位氨基酸Gln突變產物有效分離。

2.3 蛋白多肽藥物的性質研究 毛細管電泳對蛋白多肽藥物的性質研究主要包括:等電點測定、分子量測定和穩(wěn)定性研究等。

應用CIEF技術可以準確測定蛋白多肽的等電點。原理是先對一系列已知等電點的蛋白進行電泳，得到一條以等電點值為縱坐標，相對遷移值為橫坐標的標準曲線，然后對樣品進行電泳測定相對遷移值求其等電點。傳統(tǒng)的凝膠等電聚焦毛細管電泳需要先將蛋白在毛細管內聚焦，聚焦完成后將蛋白遷移至毛細管檢測窗口端進行檢測。遷移過程中容易導致pH梯度扭曲，從而使區(qū)帶展寬、分離度下降、重現性差;文獻報道了加拿大的 Convergent Bioscience公司的iCE280毛細管等電聚焦電泳儀測定免疫球蛋白(糖基化)、重組人生長激素－健豪寧(非糖基化)、生長激素抑制劑－somavert(PEG化)的等電點。iCE280采用全透明的毛細管柱，電泳過程中沒有蛋白聚焦完成后的遷移過程，并且對聚焦過程實時檢測，方法優(yōu)化簡單、分辨率高、重現性好。

毛細管SDS－凝膠電泳可以對蛋白多肽分子量進行測定。廖海明等使用了葡聚糖為分離介質，線性聚丙烯酰胺涂漬毛細管柱為支持介質，測定了15種蛋白質的分子量，并與平板SDS－聚丙烯酰胺膠電泳(SDS－PAGE)測定的結果進行了比較，兩種方法的結果具有良好的一致性。

2.4 蛋白多肽藥物的結構分析 蛋白多肽藥物的肽譜結構分析，這需要先將蛋白質、多肽酶解，然后用CE分離獲得“指紋圖譜”，以提供蛋白質及多肽的結構信息。Schuchert－Shi等［6］利用非接觸電導檢測器CE對胃蛋白酶和胰蛋白酶降解的細胞色素C、人血清白蛋白、牛血清白蛋白等產物進行分析，將降解的肽段和氨基酸碎片成功分離并檢測;Busnel等采用了含兩性電解質載體的電泳緩沖液以及ESI－MS檢測器對胰蛋白酶降解的細胞色素C、β－乳球蛋白和鐵傳遞蛋白產物進行了分離。

2.5 蛋白多肽藥物的藥代動力學研究 蛋白多肽藥物的藥代動力學是藥代動力學研究中的難點之一。毛細管電泳具有高的分辨率和靈敏度，在用于進入人體內的蛋白多肽藥物的吸收、分布、排泄等研究方面，即臨床藥物分析中顯示了它獨特的優(yōu)勢。

Guzman等綜述了親和毛細管電泳(immunoaffinity capillary electrophoresis，IACE)用于生物基質中低濃度的生物標志物、蛋白藥物以及代謝產物的檢測。親和免疫原理同抗原抗體結合反應，其生物選擇性吸附機制以及將被分析樣品富集，使之具有更高的選擇性和靈敏度，滿足藥代動力學的測定要求。

3 毛細管電泳在各國藥典中的應用

《中國藥典》在2000年版(二部)的附錄色譜法中，第一次收錄了毛細管電泳法，2005年版對方法進行了進一步的補充，但是暫無具體的藥物品種在鑒別、檢查、含量測定項下采用毛細管電泳的方法。

《英國藥典》(BP)在2000年版附錄中第一次收錄了毛細管電泳法。BP(2009)中，現已有7個品種應用了毛細管電泳方法，如谷胱甘肽有關物質的測定采用了CZE方法。《歐洲藥典》(EP)在2001年第3版附錄中第一次收錄毛細管電泳。EP(6.0)版本中收錄了除BP(2009)中7個品種外，還在Erythropoietin concentrated solution(EPO，促紅細胞生成素)中的鑒別項下采用了CZE方法。

《美國藥典》(USP)24版的第二增補本中收錄了毛細管電泳法，詳細地介紹了它的定義、分類、基本原理、儀器構造及其操作參數。USP(32)中收錄了4個品種采用毛細管電泳法，如肝素鈉的鑒別采用了CZE方法。

4 展望

毛細管電泳法的特點是樣品和緩沖液用量少、分離快速高效、有多種分離模式以適用于不同的分離對象，它已成為研究蛋白多肽藥物最具吸引力的工具之一。隨著毛細管電泳儀器和方法的不斷發(fā)展完善，逐步提高進樣精密度，解決毛細管內壁對蛋白質的吸附等問題，從而提高電泳遷移時間的重復性和定量的準確性，將會有越來越多的藥品應用毛細管電泳來進行分析研究。

［1］Jorgenson J W，Lukacs K D.Zone electrophoresis in open－ tubular glass capillaries.Anal Chem，1981，53(8):1298－1302.

［2］Wielgos T，Havel K，Ivanova N，et al.Determination of impurities in heparin by capillary electrophoresis using high molarity phosphate buffers［J］.J Pharm Biomed Anal，2009，49(2):319 －326.

［3］Somsen GW，Tak Y，Torano J，et al.Determination of oversulfated chondroitin sulfate and dermatan sulfate impurities in heparin by capillary electrophoresis［J］.J Chromatogr A，2009，1216:4107 －4112.

［4］Pessi A，Bianchi E，Chuappinelli L，et al.Applicaiton of capillary zone electrophoresis to the characterization of multiple antigen peptides［J］.J Chromatogr A，1991，557(1－2):307－313.

［5］Catai J，Torano J，Jongen P，et al.Analysis of recombination human growth hormone by capillary electrophoresis with bilayer－coated capillaries using UV and MS detection［J］.J Chromatogr B，2007，852(1 －2):160 －166.

［6］Schuchert－Shi A，Hauser P.Peptic and tryptic digestion of peptides and proteins monitored by capillary electrophoresis with contactless conductivity detection［J］.Anal Biochem，2009，387(2):202 －207.