冰淇淋檢驗中大腸菌群MPN計數法不確定度的評定

郜杏麗

一切測量結果都不可避免的具有不確定度，廣義而言，測量不確定度意為對測量結果正確性的可疑程度。測量過程中的隨機效應和系統效應均會導致測量不確定度，數據處理中的修約也會導致不確定度，測量不確定度是評定測量水平的指標，是判定測量結果質量的依據，大腸菌群的檢測也不例外。大腸菌群是評價食品衛生質量的重要指標之一，該菌主要來源于人畜糞便故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛生質量，推斷食品中是否有腸道致病菌的可能，本文根據CNAS-GL05：2006《測量不確定度要求的實施指南》、JJF1059-1999《測量不確定度評定與表示》和GB4789.3-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》對同一份冰淇淋中大腸菌群同時檢測15次的結果作不確定度的評定。

1 評定方法

1.1 檢測過程 依據GB4789.3-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》以無菌吸管吸取25 ml溶化的冰淇淋置盛有225 ml生理鹽水的無菌錐形瓶中，充分混勻，制成1∶10的樣品勻液。調節pH在6.5～7.5之間。用1 ml無菌吸管吸取1∶10的樣品勻液1 ml，沿管壁緩緩注入9 ml生理鹽水的無菌試管中，振搖試管，使其混合均勻，制成1∶100的樣品勻液。根據對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液，每遞增稀釋1次，換用一支1 ml無菌吸管。選擇3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯，每管接種1 ml，36℃ ±1℃培養24 h±2 h，觀察倒管內是否有氣泡產生，24 h±2 h產氣者進行復發酵試驗，如未產氣則繼續培養至48 h±2 h，產氣者進行復發酵試驗，未產氣者為大腸菌群陰性。用接種環從產氣的LST肉湯管中分別取培養物1環，移種于煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯管中，36℃ ±1℃培養48 h±2 h，觀察產氣情況。產氣者，計為大腸菌群陽性管。根據確證的大腸菌群LST陽性管數，檢索MPN表，報告每毫升樣品中大腸菌群MPN值。

1.2 不確定度的來源分析 檢驗步驟主要包括樣品取樣、稀釋、檢測、培養等。由于結果的散發性較大這一特點，我們只對稱量、稀釋、及重復檢測引起的不確定度進行分析量化。主要有以下幾個分量：

Ua稱量引起的不確定度;

Ub稀釋引起的不確定度;

Un重復檢測結果引起的不確定度。

1.3 建立數學模型

式中：

A-樣品中大腸菌群數，MPN/ml;

N-查表得到的大腸菌群數，MPN/ml;

V-稀釋倍數。

1.4 不確定度分量評定

1.4.1 取樣產生的不確定度Ua根據常用玻璃量器檢定規程，25 ml刻度吸管允許誤差為±0.200 ml，按均勻分布計算屬B類不確定度。

0.200÷√3=0.116 ml，樣品實際吸取 25 ml，Ua=0.116÷25=0.0046。

1.4.2 稀釋引起的不確定度Ub根據常用玻璃量器檢定規程250 ml量筒允許誤差為±2.0 ml。10 ml刻度吸管允許誤差為±0.05 ml。1 ml刻度吸管允許誤差為±0.008 ml。按均勻分布計算屬B類不確定度。

250 ml量筒：2.0 ml÷√3=1.156 ml稀釋液實際量取225 ml

Ub1=1.156 ml÷225 ml=0.00514

10 ml刻度吸管：0.05 ml÷√3=0.028 ml

Ub2=0.028÷10 ml=0.0028

1 ml刻度吸管：0.008 ml÷√3=0.0046 ml

Ub3=0.0046 ml÷1 ml=0.0046

以上三項合成得出：

Ub=√0.005142+0.00282+0.00462=0.0074

1.4.3 重復性檢測引起的不確定度Un

同一個樣品重復檢測15次所得的大腸菌群結果差異所引起的不確定度，屬A類不確定度，由于大腸菌群的生長繁殖是以幾何級數遞增的，所以結果的發散性較大，應用貝塞爾公式計算標準差時才用取對數的方法，見表1。

檢測結果平均值為7.793±lgX平均值為0.878±±S=0.119±±即Un=0.1190

1.5 合成不確定度Uc

Uc=√Ua2+Ub2+Un2=√0.00462+0.00742+0.11902=0.1193

1.6 擴展不確定度U 取置信水平P=0.95，自由度r=14，查 t分布表得;t95(14)=2.145，則擴展不確定度：U=2.145 0.1193=0.2559

表1 同一樣品15次檢測結果每ml大腸菌群MPN值

2 結果

通過本次實驗所得的擴展不確定度推算出大腸菌群的對數值范圍為0.878±0.2559，即0.6221～1.1339，取反對數后，樣品中大腸菌群含量的取值范圍為4.189～13.611 mPN/ml。而忽略B類不確定度，僅由重復檢測引入的不確定度所得的擴展不確定度U*=2.145 0.1190=0.2553，大腸菌群的對數值范圍為0.878±0.2553，即0.6227～1.1333，取反對數后，樣品中大腸菌群含量的取值范圍為4.195～13.593 mPN/ml。兩者結果幾乎相同，若保留小數點后一位小數，則兩者均為4.2～13.6。

3 討論

根據CNAS-GL05：2006《測量不確定度要求的實施指南》對那些比最大分量的三分之一還小的分量不必仔細評估。通常只需對其估計一個上限即可，重點應放在識別并仔細評估那些重要的分量特別是占支配地位的分量上。從本次試驗結果來看，重復性檢測引入的不確定度是占支配地位的重要分量，而稱量引入的不確定度Ua/重復檢測結果引起的不確定度Un=0.039，稀釋引起的不確定度Ub/重復檢測結果引起的不確定度Un=0.062，均＜0.33，因此由稱量和稀釋引入的不確定度與重復性檢測引入的不確定度相比是極次要的分量，可以忽略不計。所以對冰淇淋檢驗中大腸菌群不確定度的評定，相對來說就簡單易行了，日常工作中我們只需要考慮重復檢測所引起入的不確定度。本方法適用于同類樣品大腸菌群MPN計數法檢測中的不確定度評定。

［1］JJF1059-1999.測量不確定度評定與表示.

［2］cANS-CL07.測量不確定度評估和報告通用要求.

［3］gB4789.3-2010.食品安全國家標準食品微生物學檢驗 大腸菌群計數.