三苯氧胺對晚期大腸癌多藥耐藥逆轉作用研究

梁孝印

多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是腫瘤化療失敗的重要原因，逆轉MDR在腫瘤化療中愈來愈顯得重要。MDR與多種因素密切相關，其中最重要的是MDR基因的過度表達與其編碼產物P-糖蛋白的增多。大腸癌早期診斷困難，且很多患者因健康狀況等原因而不能手術。逆轉化療中出現的MDR，對大腸癌患者顯得愈發重要。本研究通過檢測外周血淋巴細胞膜P-gp含量，臨床篩選產生多藥耐藥的晚期大腸癌患者，對比觀察三苯氧胺預處理對FOLFOX4化療方案(奧沙利鉑聯合5-氟尿嘧啶/亞葉酸鈣)化療作用及外周血淋巴細胞膜P-gp含量的影響。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器 鼠抗人P-gp單克隆抗MRK16，免疫陰性對照抗體羊抗鼠IgG，及羊抗鼠IgG-FIFC(異硫氰酸熒光素標記)，均購自法國國際免疫公司;淋巴細胞分離液購自中國醫學科學院血液研究所;三苯氧胺為上海華聯制藥公司產品，奧沙利鉑及亞葉酸鈣由江蘇恒瑞醫藥股份有限公司生產，氟尿嘧啶由上海旭東海普藥業有限公司生產。LD4-2A型低速離心機，北京醫用離心機廠;FACScan型流式細胞儀，美國BD公司。

1.2 試驗樣本

1.2.1 臨床資料 62例大腸癌患者均為2009年6月至2010年8月在泰安市中心醫院經病理學證實(手術或活檢)為大腸癌，均經過3療程(含3療程)以上奧沙利鉑-氟尿嘧啶方案治療。所有病例入組前采外周靜脈血2 ml，分離淋巴細胞，以流式細胞儀檢測淋巴細胞膜 P-gp含量，表達陽性患者入選。入選病例隨機分為三苯氧胺組33例和單純化療組29例。三苯氧胺組男20例，女13例，年齡33～76歲，中位年齡52歲;單純化療組男19例，女10例，年齡31～72歲，中位年齡49歲。P-gp正常對照組，選擇住院非惡性腫瘤患者30例，男19例，女11例，年齡21～76歲，中位年齡51歲，測定其淋巴細胞膜P-gp含量，計算P-gp表達陽性界值。

1.2.2 標本制備 外周血淋巴細胞提取及制備參見文獻［1］，取靜脈血2 ml，以2% 乙二胺四乙酸鈉(EDT A)抗凝(1∶9)，加入淋巴細胞分離液2 ml，以1500 r/min離心5 min，提取淋巴細胞，PBS漂洗，1500 r/min離心5 min，2次，去上清，70%乙醇固定。檢測前，先以PBS漂洗樣品懸液1次，1500 r/min離心5 min，除去固定劑，調整懸液細胞數在109/L左右，再將每份懸液分別加入兩試管中，其一加入 20 μl MRK16，其二加入20 μl羊抗鼠IgG(以排除非特異免疫反應誤差)，室溫放置20 min，2000 r/min離心5 min，共3次，再向兩試管中分別加入20 μl羊抗鼠IgG-FIFC，室溫避光放置30 min，2000 r/min 離心5 min，3 次，PBS 漂洗，待檢。

1.3 外周血淋巴細胞膜P-gp含量檢測 用流式細胞儀收集2萬個淋巴細胞進行檢測，在Macintosh 650型計算機上應用Cell Ques Plot軟件(美國BD公司)分析數據結果。P-gp含量以P-gp陽性細胞百分率表示，計算公式為：P-gp陽性細胞%=P-gp陽性細胞數/(P-gp陽性細胞數+P-gp陰性細胞數-非特異結合細胞)×100%。

P-gp陽性判斷標準：取正常人外周血淋巴細胞P-gp含量的95%可信限，即均值+標準差為界值×2，檢測值大于此值判斷為P-gp陽性，小于或等于此值判斷為陰性［1］。

1.4 治療方法 三苯氧胺組于化療3 d前開始口服三苯氧胺40 mg/d，隨后行草酸鉑(L-OHP)85 mg/m-2靜脈滴入，第1天;亞葉酸鈣(CF)200 mg/m2，靜脈滴注 2 h，第1～2天;CF后5-氟尿嘧啶(5-Fu)400 mg/m2快速靜脈推注，繼以5-Fu 600 mg/m2持續靜脈滴入22 h，第1～2天，2周為1個周期。化療組不給予三苯氧胺，僅完成相同FOLFOX4方案化療。

1.5 臨床觀察及統計學處理 兩組病例均行化療4個周期后評價療效，化療結束后第2天采集血液樣本進行外周血淋巴細胞膜 P-gp含量檢測。療效評定標準按 WHO統一標準［2］：療效分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩定(SD)、進展(PD);不良反應分為 0～Ⅳ度。以CR+PR/總例數×100%計算有效率。統計學處理使用SAS軟件，計量資料應用t檢驗，計數資料應用χ2檢驗，療效分析應用秩和檢驗。

2 結果

2.1 正常人P-gp含量 正常人外周血淋巴細胞膜P-gp含量為(1.47% ±0.26)%，計算 P-gp陽性界值：(1.47+0.26)%=1.99%，外周血淋巴細胞膜P-gp含量大于1.99%病例入選。

2.2 P-gp含量變化 兩組病例外周血淋巴細胞膜P-gp含量變化見表1。

表1 外周血淋巴細胞膜P-gp含量

2.3 P-gp轉陰率 外周血淋巴細胞膜P-gp轉陰率，單純化療組為7.00%，三苯氧胺組為36.00%。兩組比較，三苯氧胺組轉陰率明顯高于單純化療組，(P＜0.01)。

2.4 臨床療效 兩組臨床療效比較見表2。三苯氧胺組的總有效率、中位生存期和1年生存率都比單純化療組高，兩組間比較差異有統計學意義。

表2 兩組臨床療效比較

2.5 毒性與不良反應 兩組毒性與不良反應基本相同。主要是血液學毒性及消化道反應，但均為Ⅰ～Ш級，在所有病例中均未出現Ⅳ級。經粒細胞集落刺激因子及TH-3受體阻斷劑對癥處理，所有患者均完成1～3療程化療。

3 討論

多藥耐藥是指腫瘤細胞由某一抗癌藥物誘發產生耐藥性，往往同時對其他化學結構和作用機制不同的藥物產生交叉耐藥的一種現象［2］。化療后腫瘤細胞產生的多藥耐藥(MDR)常使化療難以奏效并最終導致化療失敗。已證明MDR與P-糖蛋白(P-gp)高表達有關。P-gp陽性表達于胰導管上皮，肝細胞的膽管面、小腸和大腸的腔膜面等，這些正常組織陽性表達的主要作用是與拮抗外源性毒素、代謝產物的排泄以及增強細胞吞噬有關［3］。P-gp作為一種ATP酶活性的跨膜泵或“換位酶”，將進入細胞的化療藥物泵出或使其外流，而維持細胞內化療藥物的低濃度水平，導致腫瘤細胞對化療藥物的多藥耐藥。P-gp不僅在腫瘤細胞膜上表達，人外周血淋巴細胞(如NK細胞、T細胞、B細胞等)如長期受某些化學藥物的作用，其細胞膜上P-gp表達也會顯著增加［4］。從而可以通過外周血淋巴細胞膜P-gp含量檢測腫瘤耐藥和尋找逆轉腫瘤耐藥藥物。

以P-gp及其他耐藥相關蛋白為作用靶點，篩選耐藥相關蛋白逆轉劑，找尋對耐藥腫瘤細胞有效的凋亡誘導劑，對腫瘤治療具有重要意義。體外實驗發現，大劑量使用三苯氧胺可以獲得足夠濃度而能逆轉P-gp/mdr1介導的MDR［5］。裸鼠實驗研究亦表明，體內使用三苯氧胺能增強阿霉素的抑制腫瘤生長作用，即可以逆轉其MDR表型，增加化療敏感性［6］。三苯氧胺可部分逆轉淋巴細胞mdr1表達陽性的非小細胞肺癌患者多藥耐藥性，顯著提高EMP方案對耐藥的非小細胞肺癌患者的療效［1］。我們的實驗表明，三苯氧胺能降低外周血淋巴細胞膜P-gp含量，提高外周血淋巴細胞膜P-gp轉陰率，提高化療總有效率，延長生存期，是一有效的耐藥相關蛋白逆轉劑。

相信隨著人們對惡性腫瘤多藥耐藥機制及MDR逆轉劑的研究，必將會找到更多的辦法來克服腫瘤的耐藥性，更好地指導臨床化療，減少盲目性，提高預見性，為腫瘤的綜合治療找到更多的辦法。

［1］郭軍，王寶成，尹格平.三苯氧胺對淋巴細胞mdrl表達陽性的非小細胞肺癌患者多藥耐藥性的逆轉作用.臨床腫瘤學雜志，1998，4(12)：19-22.

［2］BiedLer JL，Riehm H.Celluar resistance to actinomycin D in Chinese hemster cells in vitro：cross-resistance，radioautographic and cytogenetic studies.Cancer Res，1970，30(6)：1174-1184.

［3］穆寶忠，隋秀芳.腫瘤多藥耐藥基因p-糖蛋白及其耐藥逆轉的研究進展. 臨床醫藥實踐，2010，19(4)：245-246.

［4］Chau dary PM，Mech etner EB，Ronins on IB.Expression and activity of the multidrug resistance P-gly coprotein in human peripheral blood lymphocytes.Blood，1992，80(11)：2735-2739.

［5］沈歷宗，吳文溪，武正炎.大腸癌多藥耐藥性研究進展.國外醫學外科學分冊，1998，25(4)：218-222.

［6］沈歷宗，吳文溪.三苯氧胺逆轉大腸癌多藥耐藥性的研究.中華實驗外科雜志，2000，17(1)：65-66.