三苯氧胺對晚期大腸癌多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用研究

梁孝印

多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是腫瘤化療失敗的重要原因，逆轉(zhuǎn)MDR在腫瘤化療中愈來愈顯得重要。MDR與多種因素密切相關(guān)，其中最重要的是MDR基因的過度表達與其編碼產(chǎn)物P-糖蛋白的增多。大腸癌早期診斷困難，且很多患者因健康狀況等原因而不能手術(shù)。逆轉(zhuǎn)化療中出現(xiàn)的MDR，對大腸癌患者顯得愈發(fā)重要。本研究通過檢測外周血淋巴細胞膜P-gp含量，臨床篩選產(chǎn)生多藥耐藥的晚期大腸癌患者，對比觀察三苯氧胺預(yù)處理對FOLFOX4化療方案(奧沙利鉑聯(lián)合5-氟尿嘧啶/亞葉酸鈣)化療作用及外周血淋巴細胞膜P-gp含量的影響。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器 鼠抗人P-gp單克隆抗MRK16，免疫陰性對照抗體羊抗鼠IgG，及羊抗鼠IgG-FIFC(異硫氰酸熒光素標(biāo)記)，均購自法國國際免疫公司;淋巴細胞分離液購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所;三苯氧胺為上海華聯(lián)制藥公司產(chǎn)品，奧沙利鉑及亞葉酸鈣由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，氟尿嘧啶由上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。LD4-2A型低速離心機，北京醫(yī)用離心機廠;FACScan型流式細胞儀，美國BD公司。

1.2 試驗樣本

1.2.1 臨床資料 62例大腸癌患者均為2009年6月至2010年8月在泰安市中心醫(yī)院經(jīng)病理學(xué)證實(手術(shù)或活檢)為大腸癌，均經(jīng)過3療程(含3療程)以上奧沙利鉑-氟尿嘧啶方案治療。所有病例入組前采外周靜脈血2 ml，分離淋巴細胞，以流式細胞儀檢測淋巴細胞膜 P-gp含量，表達陽性患者入選。入選病例隨機分為三苯氧胺組33例和單純化療組29例。三苯氧胺組男20例，女13例，年齡33～76歲，中位年齡52歲;單純化療組男19例，女10例，年齡31～72歲，中位年齡49歲。P-gp正常對照組，選擇住院非惡性腫瘤患者30例，男19例，女11例，年齡21～76歲，中位年齡51歲，測定其淋巴細胞膜P-gp含量，計算P-gp表達陽性界值。

1.2.2 標(biāo)本制備 外周血淋巴細胞提取及制備參見文獻［1］，取靜脈血2 ml，以2% 乙二胺四乙酸鈉(EDT A)抗凝(1∶9)，加入淋巴細胞分離液2 ml，以1500 r/min離心5 min，提取淋巴細胞，PBS漂洗，1500 r/min離心5 min，2次，去上清，70%乙醇固定。檢測前，先以PBS漂洗樣品懸液1次，1500 r/min離心5 min，除去固定劑，調(diào)整懸液細胞數(shù)在109/L左右，再將每份懸液分別加入兩試管中，其一加入 20 μl MRK16，其二加入20 μl羊抗鼠IgG(以排除非特異免疫反應(yīng)誤差)，室溫放置20 min，2000 r/min離心5 min，共3次，再向兩試管中分別加入20 μl羊抗鼠IgG-FIFC，室溫避光放置30 min，2000 r/min 離心5 min，3 次，PBS 漂洗，待檢。

1.3 外周血淋巴細胞膜P-gp含量檢測 用流式細胞儀收集2萬個淋巴細胞進行檢測，在Macintosh 650型計算機上應(yīng)用Cell Ques Plot軟件(美國BD公司)分析數(shù)據(jù)結(jié)果。P-gp含量以P-gp陽性細胞百分率表示，計算公式為：P-gp陽性細胞%=P-gp陽性細胞數(shù)/(P-gp陽性細胞數(shù)+P-gp陰性細胞數(shù)-非特異結(jié)合細胞)×100%。

P-gp陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：取正常人外周血淋巴細胞P-gp含量的95%可信限，即均值+標(biāo)準(zhǔn)差為界值×2，檢測值大于此值判斷為P-gp陽性，小于或等于此值判斷為陰性［1］。

1.4 治療方法 三苯氧胺組于化療3 d前開始口服三苯氧胺40 mg/d，隨后行草酸鉑(L-OHP)85 mg/m-2靜脈滴入，第1天;亞葉酸鈣(CF)200 mg/m2，靜脈滴注 2 h，第1～2天;CF后5-氟尿嘧啶(5-Fu)400 mg/m2快速靜脈推注，繼以5-Fu 600 mg/m2持續(xù)靜脈滴入22 h，第1～2天，2周為1個周期。化療組不給予三苯氧胺，僅完成相同F(xiàn)OLFOX4方案化療。

1.5 臨床觀察及統(tǒng)計學(xué)處理 兩組病例均行化療4個周期后評價療效，化療結(jié)束后第2天采集血液樣本進行外周血淋巴細胞膜 P-gp含量檢測。療效評定標(biāo)準(zhǔn)按 WHO統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)［2］：療效分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)、進展(PD);不良反應(yīng)分為 0～Ⅳ度。以CR+PR/總例數(shù)×100%計算有效率。統(tǒng)計學(xué)處理使用SAS軟件，計量資料應(yīng)用t檢驗，計數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗，療效分析應(yīng)用秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 正常人P-gp含量 正常人外周血淋巴細胞膜P-gp含量為(1.47% ±0.26)%，計算 P-gp陽性界值：(1.47+0.26)%=1.99%，外周血淋巴細胞膜P-gp含量大于1.99%病例入選。

2.2 P-gp含量變化 兩組病例外周血淋巴細胞膜P-gp含量變化見表1。

表1 外周血淋巴細胞膜P-gp含量

2.3 P-gp轉(zhuǎn)陰率 外周血淋巴細胞膜P-gp轉(zhuǎn)陰率，單純化療組為7.00%，三苯氧胺組為36.00%。兩組比較，三苯氧胺組轉(zhuǎn)陰率明顯高于單純化療組，(P＜0.01)。

2.4 臨床療效 兩組臨床療效比較見表2。三苯氧胺組的總有效率、中位生存期和1年生存率都比單純化療組高，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 兩組臨床療效比較

2.5 毒性與不良反應(yīng) 兩組毒性與不良反應(yīng)基本相同。主要是血液學(xué)毒性及消化道反應(yīng)，但均為Ⅰ～Ш級，在所有病例中均未出現(xiàn)Ⅳ級。經(jīng)粒細胞集落刺激因子及TH-3受體阻斷劑對癥處理，所有患者均完成1～3療程化療。

3 討論

多藥耐藥是指腫瘤細胞由某一抗癌藥物誘發(fā)產(chǎn)生耐藥性，往往同時對其他化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機制不同的藥物產(chǎn)生交叉耐藥的一種現(xiàn)象［2］。化療后腫瘤細胞產(chǎn)生的多藥耐藥(MDR)常使化療難以奏效并最終導(dǎo)致化療失敗。已證明MDR與P-糖蛋白(P-gp)高表達有關(guān)。P-gp陽性表達于胰導(dǎo)管上皮，肝細胞的膽管面、小腸和大腸的腔膜面等，這些正常組織陽性表達的主要作用是與拮抗外源性毒素、代謝產(chǎn)物的排泄以及增強細胞吞噬有關(guān)［3］。P-gp作為一種ATP酶活性的跨膜泵或“換位酶”，將進入細胞的化療藥物泵出或使其外流，而維持細胞內(nèi)化療藥物的低濃度水平，導(dǎo)致腫瘤細胞對化療藥物的多藥耐藥。P-gp不僅在腫瘤細胞膜上表達，人外周血淋巴細胞(如NK細胞、T細胞、B細胞等)如長期受某些化學(xué)藥物的作用，其細胞膜上P-gp表達也會顯著增加［4］。從而可以通過外周血淋巴細胞膜P-gp含量檢測腫瘤耐藥和尋找逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥藥物。

以P-gp及其他耐藥相關(guān)蛋白為作用靶點，篩選耐藥相關(guān)蛋白逆轉(zhuǎn)劑，找尋對耐藥腫瘤細胞有效的凋亡誘導(dǎo)劑，對腫瘤治療具有重要意義。體外實驗發(fā)現(xiàn)，大劑量使用三苯氧胺可以獲得足夠濃度而能逆轉(zhuǎn)P-gp/mdr1介導(dǎo)的MDR［5］。裸鼠實驗研究亦表明，體內(nèi)使用三苯氧胺能增強阿霉素的抑制腫瘤生長作用，即可以逆轉(zhuǎn)其MDR表型，增加化療敏感性［6］。三苯氧胺可部分逆轉(zhuǎn)淋巴細胞mdr1表達陽性的非小細胞肺癌患者多藥耐藥性，顯著提高EMP方案對耐藥的非小細胞肺癌患者的療效［1］。我們的實驗表明，三苯氧胺能降低外周血淋巴細胞膜P-gp含量，提高外周血淋巴細胞膜P-gp轉(zhuǎn)陰率，提高化療總有效率，延長生存期，是一有效的耐藥相關(guān)蛋白逆轉(zhuǎn)劑。

相信隨著人們對惡性腫瘤多藥耐藥機制及MDR逆轉(zhuǎn)劑的研究，必將會找到更多的辦法來克服腫瘤的耐藥性，更好地指導(dǎo)臨床化療，減少盲目性，提高預(yù)見性，為腫瘤的綜合治療找到更多的辦法。

［1］郭軍，王寶成，尹格平.三苯氧胺對淋巴細胞mdrl表達陽性的非小細胞肺癌患者多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用.臨床腫瘤學(xué)雜志，1998，4(12)：19-22.

［2］BiedLer JL，Riehm H.Celluar resistance to actinomycin D in Chinese hemster cells in vitro：cross-resistance，radioautographic and cytogenetic studies.Cancer Res，1970，30(6)：1174-1184.

［3］穆寶忠，隋秀芳.腫瘤多藥耐藥基因p-糖蛋白及其耐藥逆轉(zhuǎn)的研究進展. 臨床醫(yī)藥實踐，2010，19(4)：245-246.

［4］Chau dary PM，Mech etner EB，Ronins on IB.Expression and activity of the multidrug resistance P-gly coprotein in human peripheral blood lymphocytes.Blood，1992，80(11)：2735-2739.

［5］沈歷宗，吳文溪，武正炎.大腸癌多藥耐藥性研究進展.國外醫(yī)學(xué)外科學(xué)分冊，1998，25(4)：218-222.

［6］沈歷宗，吳文溪.三苯氧胺逆轉(zhuǎn)大腸癌多藥耐藥性的研究.中華實驗外科雜志，2000，17(1)：65-66.