星形膠質細胞在完全弗氏佐劑誘導的炎性痛中的作用

張濤 陳磊 張怡靚 李楚彥 陳仁義

星形膠質細胞活化會釋放某些炎癥因子及細胞因子與神經元相應受體結合，增強神經元興奮性[1]，從而在神經病理性痛中發揮重要作用[2]。炎性痛與神經病理性痛具有不同的發病機制[3]，因此本實驗以完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant，CFA)誘導炎性痛動物模型，觀察脊髓背角星形膠質細胞在CFA致痛模型中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料220～250 g雄性SD大鼠由第四軍醫大學實驗動物中心提供。

1.2 主要儀器和試劑機械痛敏測試儀(North Coast公司);熱痛敏測試儀(西安博邦化工有限公司);Real-time PCR反應體系及水平電泳槽(Bio-Rad公司);膠原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)PCR引物(正義鏈:5'-AGAGGGACTTCCATCCACTG-3'反義鏈:5'-GGTTGTGGACTCTTCCAGGT-3'南京金斯瑞生物科技有限公司);CFA，L-α-aminoadipate(LAA)及Real-time PCR試劑盒(Sigma公司)。

1.3 實驗分組及給藥SD大鼠隨機分為3組(n=6/組):CFA組(以60 mg/kg劑量腹腔注射4%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，俯臥位固定于手術臺上，于左下肢足底注射100 μl CFA誘導炎性痛模型，同時參照文獻[3]行鞘內置管術，術后6 d鞘內給予生理鹽水10 μl);LAA組(處理方式同CFA組，但鞘內給予LAA溶液10 μl);對照組(處理方式同CFA組，但足底及鞘內均給予生理鹽水)。LAA藥物配置:以生理鹽水配制，濃度為100 nmol/10 μl。

1.4 疼痛閾值的檢測參照文獻所述方法[2]，于術前2 d及術后7 d運用von Frey絲檢測大鼠左后肢足底機械性痛域，運用Hargreaves熱輻射法檢測大鼠左后肢足底熱痛閾。

1.5 Real-time PCR檢測大鼠脊髓背角GFAP mRNA變化行為學測試之后，腹腔注射4%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠(60 mg/kg)，剝離脊髓腰膨大，分離腹背側，參照文獻[4]反轉錄脊髓背角GFAP mRNA，利用公式2-deltadeltaCt分析數據結果。

1.6 統計學方法數值以均數±標準差表示，利用SPSS 17.0軟件行單因素方差分析LSD檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 鞘內注射LAA可緩解CFA大鼠左后肢足底炎性痛術前2 d各組左后肢足底熱痛閾及機械痛域無明顯差別(P＞0.05)。術后7 d，CFA組左后肢足底機械痛及熱痛閾值較對照組明顯降低(P＜0.01)，出現了明顯的炎性痛表現;鞘內注射LAA可緩解CFA大鼠左后肢足底炎性痛，LAA組左后肢足底機械痛及熱痛閾值較CFA組明顯升高(P＜0.01)(表1，表2)。

表1 各組大鼠左后肢足底機械痛閾值

表2 各組大鼠左后肢足底熱痛閾值(S)

2.2 鞘內注射LAA抑制CFA大鼠脊髓背角星形膠質細胞活化GFAP是星形膠質細胞活性標志物。Real-time PCR檢測顯示，CFA組大鼠脊髓背角星形膠質細胞明顯活化，GFAP mRNA較對照組升高15.1%(P＜0.01)。鞘內注射LAA可抑制CFA大鼠脊髓背角星形膠質細胞活化，LAA組GFAP mRNA較CFA組下降16.2%(P＜0.01)(圖1)。

圖1 鞘內置管7 d各組大鼠脊髓背角GFAP mRNA。＊＊與對照組相比，P＜0.01;##與CFA組相比，P＜0.01

3 討論

傳統理論認為，神經元的結構和功能異常導致了痛覺的產生和持續，關于炎性痛的發病機制及治療研究也一直圍繞著神經元進行，但最近有研究表明，膠質細胞可能參與了神經病理性痛的產生與維持[2]，這為神經病理性痛提出了新的研究方向，也為炎性痛提供了新的研究思路。炎性痛與神經病理性痛發病機制不同[3]，本研究以CFA誘導的炎性痛大鼠為研究對象，觀察了該模型7 d痛覺閾值及脊髓背角GFAP(星形膠質細胞活性標志物)的mRNA變化。結果表明，大鼠足底注射CFA 7 d出現了明顯的神經病理性痛表現，脊髓背角GFAP mRNA顯著增高，星形膠質細胞活化。LAA是星形膠質細胞活性特異性抑制劑。本研究顯示，LAA明顯抑制了CFA大鼠脊髓背角星形膠質細胞活化，LAA組GFAP mRNA較CFA組明顯降低，LAA也顯著緩解了CFA大鼠炎性痛。研究結果提示脊髓背角星形膠質細胞活化參與了CFA誘導的炎性痛。

本實驗沒有對脊髓背角星形膠質細胞參與CFA炎性痛的機制進行研究，但有研究表明，星形膠質細胞活化可釋放一氧化氮、興奮性氨基酸等炎癥因子和白細胞介素-1β、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α等細胞因子，這些炎癥因子和細胞因子可與神經元相應受體結合，從而提高神經元興奮性[1]，星形膠質細胞活化還可以上調神經元谷氨酸受體的表達，增加神經元興奮性[5]，這些都可能是星形膠質細胞參與CFA誘導的炎性痛機制。

[1]Milligan ED，Watkins LR.Pathological and protective roles of glia in chronic pain.Nat Rev Neurosci，2009，10:(1):23-36.

[2]Watkins LR，Milligan ED，Maier SF.Spinal cord glia:new players in pain.Pain，2001，93(3):201-205.

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