HPLC法測(cè)定酚酞片中酚酞的含量

孫銀華

酚酞是刺激性瀉藥，主要用于治療慢性便秘。其原料、制劑收載于《中國(guó)藥典》2010年版二部，原料、片劑中酚酞含量均采用紫外分光光度法，因分三步稀釋較為繁瑣，筆者在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，建立HPLC法測(cè)定酚酞片中酚酞含量的方法，此法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，Waters 2998 Photodiode Array Detecer二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)，Empower色譜工作站(美國(guó) Waters公司);Sunfire TM C185 μm，4.6 ×150 μm 色譜柱(美國(guó) Waters公司);JK-120超聲清洗器(上海金棋實(shí)業(yè)公司超聲電子工程部);BP211 d電子天平(德國(guó)Sartorius公司)。

1.2 試藥 酚酞對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):100091-199601);熒光母素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):100075-197902);甲醇為色譜純，其余試劑為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);酚酞片(上海信誼九福藥業(yè)有限公司，批號(hào)100501;臨汾奇林藥業(yè)有限公司，批號(hào)1009071;江蘇黃河藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)101018;山東仁和堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)091207)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱:Sunfire TM C18(5 μm，4.6×150 mm);流動(dòng)相:甲醇-0.05%磷酸溶液(70∶30);流速0.8 ml/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量為10 μl，檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm;理論板數(shù)按酚酞峰計(jì)算不低于3000，酚酞與熒光母素分離度大于15。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 ①精密稱取酚酞對(duì)照品12.50 mg置25 ml量瓶中，加乙醇15 ml超聲使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液;②精密稱取熒光母素對(duì)照品10.72 mg置50 ml量瓶中，加乙醇30 ml超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為和貯備液。精密量取貯備液5 ml和貯備液10 ml置25 ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適應(yīng)性溶液。另精密量取貯備液5 ml置25 ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取酚酞片10片，精密稱重，研細(xì)，精密稱取1片(相當(dāng)于100 mg酚酞)，置100 ml量瓶中，加乙醇60 ml，超聲使溶解，并用乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 ml置50 ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品貯備液定量稀釋制得酚酞濃度分別為:10.00、50.00、100.00、250.00 和500.00 mg/L溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件精密量取上述溶液各10ul，注入液相色譜儀，在284nm波長(zhǎng)處記錄色譜圖。酚酞峰面積分別為:98632、471451、934349、2318247 和 4698917。以濃度為橫坐標(biāo)(X)，各色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。酚酞標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=9381X-3024.6，相關(guān)系數(shù) r=0.9999，線性范圍f為10.00～500.00 mg/L。

2.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣5 次，酚酞峰面積分別為:953938、951394、957060、955841 和958128，RSD為0.28%(n=5)。結(jié)果表明本方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，分別于1、4、8、12、24 h測(cè)定，記錄峰面積分別為:953938、955841、957363、962841 和931856，RSD為1.25%(n=5)。結(jié)果表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品(批號(hào):101018)5份，按供試品溶液制備項(xiàng)制備及上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果其標(biāo)示量含量分別為97.19%、97.11%、97.30%、96.20%、96.43% 平均值為96.85%，RSD=0.50%(n=5)。結(jié)果表明本法測(cè)定樣品重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品(批號(hào):101018)5份，分別精密加入同一對(duì)照品溶液，按供試品溶液的制備方法及上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。酚酞的平均回收率為100.10%，RSD=0.26%(n=5)，實(shí)驗(yàn)表明，本法準(zhǔn)確性較好。

表1 加樣回收率試驗(yàn)(n=5)

圖1 酚酞片中酚酞含量測(cè)定的HPLC色譜圖

2.9 樣品含量測(cè)定 取4批樣品分別按上述方法制備及色譜條件測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算含量，并與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)測(cè)的酚酞含量進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 參閱相關(guān)資料［1-3］，選擇甲醇-0.05%磷酸為流動(dòng)相，通過調(diào)整比例和流速進(jìn)行考察后發(fā)現(xiàn)，以甲醇-0.05%磷酸(70∶30)流速0.8 ml/min為流動(dòng)相時(shí)，酚酞和熒光母素分離效果好，保留時(shí)間、對(duì)稱因子、塔板數(shù)均符合要求。

表2 酚酞片含量測(cè)定結(jié)果(標(biāo)示量的百分含量%)

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 采用PDA檢測(cè)器，采集210～400 nm3d圖譜，提取酚酞色譜峰處的光譜圖，表明其在229nm與275nm波長(zhǎng)處有最大吸收，在229nm波長(zhǎng)處溶劑的紫外吸收會(huì)影響測(cè)定，故選擇275nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 溶劑的選擇 酚酞水溶性較差，可溶于甲醇、乙醇，原標(biāo)準(zhǔn)［4］采用乙醇作為溶劑，熒光母素采用無水乙醇作為溶劑。在使用甲醇作為溶劑時(shí)發(fā)現(xiàn)，熒光母素溶于甲醇后不穩(wěn)定，放置一段時(shí)間，即出現(xiàn)絮凝，改用乙醇，即無該現(xiàn)象。綜合考慮，在配置對(duì)照品貯備液時(shí)用乙醇作為溶劑，在二步稀釋時(shí)采用流動(dòng)相作為溶劑，樣品采用乙醇超聲10 min即可溶解。

［1］吳紅英.高效液相色譜法測(cè)定酚酞片中酚酞含量研究.山西醫(yī)藥雜志，2010，39(2):161-162.

［2］王玫，曹霞.HPLC法測(cè)定酚酞片的含量探討.黑龍江醫(yī)藥，2009，22(3):260-261.

［3］梁選革，伍國(guó)怡.高效液相色譜法測(cè)定酚酞溶液與酚酞片中熒光母素含量.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2006，25(11):1210-1211.

［4］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部).北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:882.