尿素對羊瘤胃液MCP和原蟲數的影響

張蘇江 李成陽

(1 塔里木大學動物科學學院，新疆阿拉爾843300)

(2 新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾843300)

微生物蛋白(MCP)是反芻動物重要的蛋白質營養來源之一，可滿足動物蛋白質營養需要量的40～80%[1]。研究表明，氨態氮是合成微生物蛋白質的原料，進入羊瘤胃內的尿素在微生物的作用下可降解為氨態氮，進一步被瘤胃微生物合成氨基酸和有機酸而被利用[2]。MCP代謝是瘤胃微生物區系營養代謝的一個重要的組成部分[3]。

尿素等非蛋白氮類飼料在反芻動物的養殖生產中已經被廣泛應用，科學合理地利用尿素等非蛋白氮飼料是解決蛋白質飼料來源不足的重要手段之一。適量利用非蛋白氮飼料可以促進反芻動物的生產性能，過量的飼喂非蛋白氮飼料往往會引起動物的中毒。然而，尿素飼喂量對瘤胃MCP含量和原蟲數量的影響鮮見報道。本研究以常用的非蛋白氮飼料尿素為材料，通過羊瘤胃液體外發酵的方法，探討尿素水平對瘤胃發酵液MCP含量和原蟲數量的影響，以期為尿素飼料的安全使用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

尿素的濃度設置為6組，分別占底物基礎飼料的0%、1%、2%、3%、4%和5%，每個濃度設3個重復樣。使用100 ml玻璃注射器作為發酵管，每個發酵管中裝取人工瘤胃液20 ml，底物2 g。體外發酵使用水浴搖床進行體外發酵，基礎飼料組成見表1。

表1 基礎飼料組成

1.2 儀器設備與瘤胃液

儀器設備:精料配合飼料、發酵管、水浴搖床、消化爐、消化管、全自動凱氏定氮儀、顯微照相儀、血細胞計數板、保溫杯等。

瘤胃液:瘤胃液采自體重30kg左右、安裝有永久瘤胃瘺管的卡拉庫爾羊。實驗于2010年11月至2011年1月在塔里木大學生物研發中心進行。

1.2.1 人工瘤胃液配制

1.2.1.1 微量元素液A:稱取氯化鈣13.2 g、氯化錳10.0 g、氯化鈷1.0 g、氯化鐵8.0 g，加入到200 ml的燒杯中，加蒸餾水攪拌，待完全溶解后，轉移到1 000 ml的容量瓶中，加蒸餾水定容到1 000 ml。

1.2.1.2 緩沖溶液B:4.0 g碳酸氫銨和35 g碳酸氫鈉加蒸餾水定容到1 000 ml。

1.2.1.3 常量元素C:5.7 g磷酸氫二鈉、6.2 g磷酸二氫鉀和0.6 g七水硫酸鎂加蒸餾水定容到1 000 ml。

1.2.1.4 還原液D:氫氧化鈉，0.625 0 g硫化鈉加水至95 ml。

1.2.2 瘤胃液體外發酵

1.2.2.1 在培養前，配制瘤胃培養液。將400 ml蒸餾水，0.1 ml溶液A，200 ml溶液B和200溶液C，40 ml還原液D配合在一起，放在39℃的水浴鍋中，然后通入二氧化碳半個小時，并用玻璃棒不斷攪動培養液。

1.2.2.2 瘤胃液采集，通過羊瘤胃瘺管采集瘤胃液，置于保溫杯中迅速的帶回實驗室，在培養液通二氧化碳半個小時后，將瘤胃液倒在4層的紗布過濾，濾出液相部分約200 ml，在將瘤胃過濾液與培養液按1:2(V:V)的比例配制人工瘤胃液，倒入容積為1 L的大燒杯中，將大燒杯放在39℃的水浴鍋中持續通二氧化碳氣體。

1.2.2.3 準備容量為100 ml玻璃注射器作為體外發酵管，最小的刻度為1 ml，注射器的前端要套上3～5 cm的軟質橡皮管，以起到密封作用。

1.2.2.4 準確稱取0.200 0 g飼料樣品，再按飼料樣品的重量分別稱取占重量百分比的0%，1%，2%，3%，4%，5%的尿素。加入到飼料樣品中，將樣品緩慢倒入到發酵管的最前端。

1.2.2.5 緩慢將20 ml人工瘤胃液吸入到玻璃注射器中，再將發酵管中的空氣排盡后，把注射器前端的軟質橡皮管打結。

1.2.2.6 將所有的發酵管放入到水浴搖床中之后開始振蕩發酵，水浴搖床的溫度設置在39℃。

1.2.2.7 在實驗過程中分別取發酵6 h，12 h和24 h后的發酵液進行原蟲的計數工作。

1.2.3 瘤胃原蟲測定

1.2.3.1 取發酵過的瘤胃培養液15 ml，用雙層紗布濾去殘渣，再取濾液1 ml，加入原生質染色液(MFS)4 ml(MFS:35%的福爾馬林100 ml，NaCl 8.0 g，甲基綠0.6 g和蒸餾水900 ml)，混勻后靜置染色半小時。原蟲蟲體細胞質不被MFS染色，細胞核則染為藍綠色。

1.2.3.2 用吸管吸取樣品稀釋液，緩慢滴加到血球計數室，蓋上蓋玻片，放在光學顯微鏡下鏡檢(100X)。每個樣品取10個視野。每個視野取10個方格，最后取平均數。

1.2.3.3 計算方法:原蟲數/ml=X/S×D×2×1000

X:所觀察的所有方格中原蟲的總數

S:計數的方格數

D:稀釋倍數(本實驗的稀釋倍數為5倍)

1.3 瘤胃液MCP的測定

1.3.1 試劑

濃硫酸(98%)、混合催化劑(0.4 g硫酸銅，6 g硫酸鉀或硫酸鈉，磨碎混勻)、飽和NaOH溶液、2%硼酸、甲基紅溴甲酚綠混合指示劑、0.1 mol/L鹽酸標準溶液、硫酸銨。

1.3.2 MCP測定

1.3.2.1 取發酵24 h的人工瘤胃液20 ml加入到容量為50 ml潔凈的離心管中進行離心，離心機轉速為1 500 rpm，溫度為4℃，離心20 min。

1.3.2.2 離心20 min后，取20 ml所得上清液裝入容量為50 ml潔凈的的離心管中(所放相對離心位置的兩個離心管重量要配平)，放入離心機中進行離心。離心機轉速設定:20 000 rpm，溫度為4℃，離心20 min。

1.3.2.3 離心20 min后，棄去上清液，再用生理鹽水沖洗離心管中的沉淀物，直到粘在離心管內壁的完全沉淀物脫落，所得沖洗液轉移到裝入容量為50 ml潔凈的離心管中，再次離心(離心機轉速20 000 rpm，溫度為4℃)離心20 min。

1.3.2.4 將離心好的細胞沉淀無損的移到濾紙上，并放到烘箱中干燥6 h，烘箱溫度設置為130℃(干燥前要先記錄濾紙的重量)。樣品干燥后稱重。

1.3.2.5 樣品蛋白質的測定按凱氏定氮法測定。樣品經完全消煮后，用全自動凱氏定氮儀測定樣品中氮的含量。

1.4 數據處理

數據經Excel進行整理后，采用SPSS13.0統計軟件進行方差分析及多重比較。顯著檢驗水平為0.05。

2 結果分析

2.1 不同濃度尿素對瘤胃MCP的影響

表2 不同濃度尿素對瘤胃MCP的影響

由表1可知，MCP含量在2%和3%尿素濃度時最高，顯著高于其它各組(P＜0.05)，但2%和3%尿素濃度組之間無顯著差異(P＞0.05)。4%和5%的尿素添加濃度MCP含量最低，顯著低于未加尿素組和1%的尿素添加組。未添加尿素組和1%的尿素添加組，MCP含量處于同一水平，未

2.2 不同濃度尿素對瘤胃原蟲數量的影響

見有顯著差異(P＞0.05)。此外，表中數據還顯示，尿素添加濃度在0%～3%個范圍內，MCP含量隨著尿素濃度的增加而增加;尿素添加濃度在3%～5%范圍內，MCP含量則隨著尿素濃度的增加而減少。

表3 不同濃度尿素對瘤胃6 h，12 h，24 h原蟲數量的影響(×104/mL)

由表3可見:原蟲數量在尿素濃度為2%和3%時顯著大于其它尿素組(P＜0.05)，原蟲數量在尿素濃度2%和3%之間無顯著差異(P＞0.05)。未添加尿素組和1%尿素濃度組間原蟲數量在同一水平，差異不顯著(P＞0.05)，但二者的原蟲數量均顯著高于4%和5%的尿素水平添加組。在尿素濃度為0%、1%、2%和3%范圍內，原蟲的數量隨尿素濃度水平增加而增加，之后，原蟲濃度則隨尿素添加濃度的增加而減少。發酵液原蟲在4%和5%的尿素濃度下數量最少。此外，瘤胃原蟲數量隨發酵時間的增加而表現出了下降趨勢。

3 討論

3.1 尿素對瘤胃MCP含量人影響

實驗結果表明，尿素濃度為3%的發酵組中MCP的含量最高，達到了1.82 mg/ml，而未加尿素對照組中MCP的含量是1.14 mg/ml，3%尿素濃度組較對照組發酵液中MCP的含量上升了59%，尿素濃度為5%發酵組MCP的含量最低是0.68 mg/ml，比對照組MCP下降了40%左右;在尿素濃度為0%，1%，2%，3%時，MCP含量隨尿素含量的增加而增加。這一結果說明，一方面，飼料中添加一定量的尿素水平有利于發酵液瘤胃微生物的增殖，進而使MCP的含量有顯著增加;另一方面，尿素添加濃度在4%和5%的水平，則對發酵液瘤胃微生物的增殖表現出了負面作用，這很可能是過高的尿素添加量會產生較多的氨態氮，使發酵液的pH環境發生了不利于瘤胃微生物增殖的變化而使其數量減少，致使MCP含量下降所致。研究表明，飼料中尿素的添加量控制在一定的濃度對MCP的合成量起促進作用，尿素在瘤胃內經過瘤胃內微生物的降解產生氨基酸、氨氮和有機酸等[4，5]。尿素使用量過多會使尿素降解產生的氨氮濃度上升，較高濃度的氨氮會存留在瘤胃內或進入血液中，使瘤胃內和血液中的pH值上升[6]，間接使瘤胃內脲酶的活性受到抑制，使瘤胃微生物對瘤胃內氨態氮的利用受阻，進而使MCP的合成量受到抑制[7]。當粗飼料中蛋白質來源不足時，添加一定量的非蛋白氮可顯著改善瘤胃內MCP的代謝[8]，這些研究結果與本實驗的結果一致。

3.2 尿素濃度與瘤胃原蟲數量的關系

發酵液瘤胃原蟲數量的變化規律與MCP的變化規律基本一致。一般認為，原蟲對提高宿主氮的利用率和生長具有積極的促進作用[9]。原蟲自身不能利用尿素分解的氨態氮合成蟲體蛋白，而是通過原蟲吞噬細菌獲取蛋白(間接利用尿素氮)，被瘤胃原蟲吞噬的細菌則可以利用尿素降解產生的氨合成細菌蛋白，合成的細菌蛋白又被原蟲利用來進行自身的生長和繁殖[10]。尿素添加濃度小于3%時，發酵液細菌的數量會隨尿素濃度的增加而增加，加快了瘤胃細菌的生長，這為原蟲的生長和增殖提供了更多的物質基礎，從而使原蟲的數量有明顯增加。有研究表明羊瘤胃細菌和原蟲數量之間存在正相關關系[11];艾曉杰等[12]人觀察了一種含銨的工業廢液(ISCA)作為非蛋白氮飼料對瘤胃蛋白質代謝的影響，結果也顯示非蛋白氮可以同步增加瘤胃細菌和原蟲數量。這些研究結果為以上推理提供了有力的佐證。相似的原因，當尿素濃度增加至4%和5%時，發酵液中瘤胃細菌數量受到過量氨態氮的毒害作用而減少，發酵液中瘤胃原蟲的數量則很可能因為吞噬細菌數量的減少，其生長和增殖受到抑制，數量顯著減少。至于瘤胃原蟲數量隨發酵時間的增加而表現出下降趨勢，其原因很可能是，隨著發酵液在體外發酵時間的延長，發酵過程產生了過多的不利于瘤胃微生物增殖有害物質造成的。

4 結論

尿素濃度在0～3%范圍內，MCP和原蟲數量均表現出隨尿素濃度增加而增加，2%和3%尿素濃度時，MCP和原蟲數量均較高，顯著高于1%和對照組，說明此濃度可促進瘤胃微生物的增殖;但是，MCP和原蟲數量在尿素濃度為4%和5%時均有顯著下降，說明尿素濃度過大則對瘤胃微生物表現出了明顯的毒害作用。

[1] 朱秀高，曹慧，劉偉，王漢東.尿素的營養與毒性研究進展[J] .飼料工業，2010(17):23－27.

[2] Bach A，Calsamiglia，Stern M D.Nitrogen metabolism in the rumen[J] .JDairy Sci，2005，88(suppl 1):E9－21.

[3] 李世霞，王洪榮，王夢芝，等.銀杏葉提取物對山羊瘤胃液體外發酵及微生物蛋白產量的影響[J] .揚州大學學報(農業與生命科學版)，2008(3):59－61.

[4] 李林，薛白.控釋尿素對藏羊瘤胃氨氮和微生物蛋白質的影響[J] .中國畜牧獸醫，2007，34(6):19－21.

[5] 張志強，郭萬志，康萍，等.應用能氮平衡理論調配生長育肥牛飼料[J] .畜禽業2007，36(8):220.

[6] 李太翔，劉凱麗，陳峰.脲酶抑制劑與非蛋白氮的利用[J] .飼料與營養研究，2004，12(3):17－18.

[7] 蔣加進，黃克和.日糧添加不同水平尿素對山羊生產性能及血液生化指標的影響[J] .畜牧獸醫，2007，39(11):51－53.

[8] 孫鎮平，陳杰，韓正康.添加非蛋白氮對水牛瘤胃微生物蛋白合成的影響[J] .西北農業大學學報，1997，25(5):64－66.

[9] Klopfenstein T J，Purser D B，Tyznik WJ.Effects of Defaunation on Feed Digestibility，Rumen Metabolism and Blood Metabolites[J] .J Anim Sci，1966，25(3):765－773.

[10] Bernard JK，West J W，Trammell D S，et al.Ruminal fermentation and bacterial protein synthesis of whole cottonseed coated with combinations of gelatinized corn starch and urea[J] .JDairy Sci，2003，86(11):3661－6.

[11] Kurihara Y，Eadie J M，Hobson P N，et al.Relationship between bacteria and ciliate protozoa in the sheep rumen[J] .JGen Microbiol，1968(51):267－288.

[12] 艾曉杰，馬萬倫，劉茗，劉敏雄.ISCA對瘤胃原蟲和微生物蛋白質含量[J] .上海交通大學學報(農業科學版)，2001，19(2):91－95.