鵝巴氏桿菌病病原分離鑒定與中藥的篩選

馬 驛,陳欽旭,陳秀眉,陳均玉,彭金菊

(廣東海洋大學動物醫學系,廣東 湛江 524088)

鵝巴氏桿菌病是由禽多殺性巴氏桿菌引起鵝的一種急性、敗血性、高度接觸性傳染病。該病的傳播途徑廣泛,具有較高的死亡率以及導致生產性能低下等特點,給養鵝業造成較大的經濟損失。目前,治療細菌性疾病的最常用藥物是抗生素和合成抗菌藥,但具有產生耐藥性、導致藥物殘留等缺點。我國傳統中藥除可克服前述缺點外,還可增強動物免疫力,因此,從中藥中提取有效的活性成分,以取代部分高殘留藥物的研究尤為重要。研究表明,中藥及中藥復方對巴氏桿菌有較好的體外抑制效果[1-3]。本試驗從湛江市某養鵝場采集病料,進行病原分離鑒定,同時選取30種常用中藥,通過測定各中藥及其復方對病原菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC),篩選出能有效抑制該菌的中藥及中藥復方,以期為實際生產中防治禽類細菌病提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 中藥材 大黃、五味子、魚腥草等30種中藥均購自湛江市藥材市場。

1.2 菌株來源 從湛江市某養鵝場采集具有典型巴氏桿菌病病理變化的病死鵝的肝、肺、脾,分離培養細菌。巴氏桿菌(C48-3)標準菌株,由中國獸醫藥品監察所提供。

1.3 培養基 各種生化培養基均為杭州天和微生物試劑有限公司生產;鮮血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、鮮血瓊脂斜面和1%豬血清肉湯參照文獻進行配制。

1.4 細菌分離純化 將肝、肺、脾等病料無菌接種于鮮血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板,37℃培養18～24 h,挑取單個菌落,再進行純培養并鑒定。

1.5 涂片染色鏡檢 挑取上述純培養菌落抹片,進行革蘭和美藍染色,鏡檢。

1.6 細菌生化試驗 將純化好的疑似巴氏桿菌菌株分別接種到不同的生化培養基中,37℃培養24～48 h,觀察結果,同時與標準菌株進行比較。

1.7 中藥藥液的制備 稱取中藥各50 g置于燒杯內,加200 m L水,置于室溫下浸泡10～30 h后加熱煮沸30 min,連續煎煮3次,冷卻,過濾,合并煎煮液,濃縮至50 m L,使藥液含原藥材達1 g/m L,置于4℃冰箱內保存備用。

1.8 單藥MIC與MBC的測定 將巴氏桿菌接種于1%豬血清營養肉湯中,37℃恒溫培養8～12 h,采用平板計數法計數,用肉湯稀釋至105CFU/m L,置于4℃冰箱內保存備用。采用液體試管二倍稀釋法測定各藥的MIC[4],取試管12支,于各管中加入菌液和藥液,使12支試管內的菌液中藥物含量分別為 :200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.782、0.391、0.196、0 mg/mL 。37℃恒溫培養,分別于24 h、48 h觀察結果。試驗重復3次。

培養24 h時,若對照管細菌生長良好發生混濁,藥液管亦發生混濁,既表示細菌生長,該濃度供試藥物無抑菌作用;若藥液管清亮,表示細菌生長受到抑制,其為能夠抑制細菌生長的最大稀釋度的藥液,即為該藥物的最小抑菌濃度(MIC)。

繼續培養至48 h,若藥液管仍清亮,將各管清亮的藥液接種于普通瓊脂平板上,培養8～12 h觀察,仍無細菌生長的最小藥物濃度即為該藥物的最小殺菌濃度(MBC)。

1.9 復方的MIC及MBC測定 根據單藥的抑菌試驗結果,篩選出8種對巴氏桿菌有較強抑菌作用的中藥作為主藥,分別與其他中藥組成復方,復方的MIC及MBC測定方法與單藥的方法相同。

2 結果

2.1 細菌分離鑒定結果

2.1.1 菌株分離培養 分離菌在普通培養基上生長貧瘠,在麥康凱培養基上不生長,在鮮血培養基上生長良好,長成淡灰白色、閃光的露珠狀小菌落,且無溶血現象。

2.1.2 涂片染色鏡檢 在光學顯微鏡下觀察發現分離菌為球桿狀或短桿狀,兩端鈍圓,以單個和成雙排列為主,革蘭染色陰性。涂片用美藍染色時可見典型的兩極著色。

2.1.3 分離株理化鑒定 詳細結果見表1,由生化特性鑒定結果可以看出分離菌株符合巴氏桿菌特征[5],初步確定為巴氏桿菌。

表1 疑似巴氏桿菌菌株的生化試驗結果

2.2 中藥對巴氏桿菌的體外抑制效果

2.2.1 單味中藥對巴氏桿菌的抑制作用 從表2可以看出,五倍子(MIC=3.125 mg/m L)、訶子(MIC=12.5 mg/m L)對巴氏桿菌的抑菌作用最好,其次是五味子、烏梅、山茱萸、石榴皮、夏枯草、梔子、魚腥草,其MIC均為25 mg/mL,青蒿、花椒、秦皮、虎杖、金銀花、紫草、大黃、皂角、茵陳、大青葉的MIC為 50 mg/m L,甘草、川蓮等 11種中藥的MIC≥100 mg/m L。殺菌作用以五倍子、五味子的效果較好,MBC均為 50 mg/m L,訶子、青蒿、甘草、川蓮的殺菌效果次之,其MBC均為100 mg/m L,其余24種中藥的MBC≥200 mg/mL。

2.2.2 中藥復方對巴氏桿菌的抑制作用 從表3、表4可以看出,五倍子、訶子、五味子、烏梅、山茱萸、石榴皮、梔子、虎杖與其他中藥組成復方后的抑菌和殺菌能力基本都大于或等于單藥。其中五倍子與黃芩、白芍、青蒿、皂角、連翹、大黃組成復方的 MIC均為0.196 mg/m L,MBC≤0.781 mg/m L;訶子與白芍、白頭翁、連翹、大黃、桂枝組成復方的抑菌效果明顯提高,MIC≤1.563 mg/m L,殺菌效果更是顯著提高,MBC≤1.563 mg/m L。

表2 單藥對巴氏桿菌的體外抑制 (mg/m L)

3 討論

3.1 細菌分離鑒定 通過病原分離、涂片鏡檢、生化鑒定,初步確定所分離的細菌為多殺性巴氏桿菌,試驗結果為該鵝場進行疾病防治奠定了病原學基礎。

3.2 中藥對巴氏桿菌的體外抑制效果 本試驗采用水煎法制備中藥藥液,該方法所需設備簡單,操作簡便,可以在較短的時間內完成大量中藥的篩選。在30種中藥中,不同藥物提取液對巴氏桿菌的抑制效果差別很大,其中五倍子、訶子、五味子、烏梅等對巴氏桿菌具有較強抑菌活性,這與王曉暉等報道訶子、五味子的水煎煮液對大腸桿菌、巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌3種致病菌都有明顯的抑菌作用結果一致[6]。李廣京等采用試管二倍稀釋法研究中藥提取物對巴氏桿菌的抑菌結果顯示烏梅(MIC為 1∶256)優于大黃、秦皮(MIC均為1∶32),本試驗中烏梅(MIC=25 mg/m L)的抑菌活性也大于大黃、秦皮(MIC均為50 mg/m L)[7]。但部分結果與資料報道的有差異,如王曉暉等采用平皿打孔法研究中藥的抑菌作用的試驗結果表明,不同中藥對巴氏桿菌的抑制作用從強到弱依次為訶子＞黃芩＞大黃＞五味子＞金銀花[6],而本試驗上述中藥對巴氏桿菌的抑制作用為訶子＞五味子＞金銀花＞大黃＞黃芩,這與所采用的試驗方法及菌株不同有關。本試驗中,部分中藥提取液對巴氏桿菌的抑制效果不佳,因此對于不同致病菌,應采用具有針對性的中藥進行治療。

表4 中藥復方對巴氏桿菌的最小殺菌濃度(MBC) (mg/m L)

與抗生素相比,中藥的抗菌活性較低,但其藥用效果是不能僅以藥物的MIC和MBC來進行評價,中藥對動物免疫機能的影響亦為評價其防治效果的重要指標[8-9]。中藥的MIC和MBC測定結果對指導臨床用藥劑量有一定的參考價值,但體外抗菌試驗只能說明所試中藥與細菌直接接觸所產生的影響,而對被細菌感染患病的動物的治療效果,必須進行動物體內試驗才能證實;另外,天然中藥對動物還具有一定的營養和整體調節作用,因此,篩選出的中藥在體內飼喂試驗中其藥效可能會有一定變化。

3.3 中藥復方的抑菌效果及前景展望 中藥復方抑菌試驗的結果顯示:五倍子、訶子、五味子、烏梅、山茱萸、石榴皮、梔子、虎杖與其他中藥聯用,抑菌效果與單藥相比普遍提高,說明這些藥物之間有協同作用,在實踐中有較大的應用價值。選擇多種具有不同藥理作用的中草藥組成中藥復方制劑,具有藥效互補、療效增強,各藥的單劑量與不良作用減少的優點,中藥復方制劑的開發是當前中藥研究的主流之一。在實際使用上更具有優勢。但中藥復方的研究中,復方中藥的有效成分并非每味中藥有效成分的總和,這些成分相互作用有簡單的物理變化和復雜的化學變化(產生新的物質)。無論是單味藥還是聯合用藥,其抑菌的具體成分、作用方式和機理如何,仍需進一步研究。

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