高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒分離株HLJ-09感染仔豬的組織病理學(xué)和電鏡觀察

姜曉晨,劉業(yè)兵,王晶鈺,張 磊,寧宜寶

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌712100;2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京海淀100081)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種豬的高度接觸性傳染病,不同年齡、品種和性別的豬均能感染,但以妊娠母豬和1月齡以內(nèi)的仔豬最易感。該病以母豬流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊以及仔豬呼吸困難、敗血癥、高死亡率等為主要特征。該病1987年在美國北卡羅來納州首先被發(fā)現(xiàn)[1],然后迅速向世界各地蔓延,給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。到目前為止,世界上僅有少數(shù)幾個(gè)國家沒有該病的發(fā)生與流行,如瑞典[3]、新西蘭[3]、澳大利亞[4]等國家。

自2006年以來,以豬體溫升高、皮膚發(fā)紅和呼吸急促等主要臨床癥狀,剖檢變化以彌散性、間質(zhì)性肺炎為突出特征的傳染病,最主要的病原為高致病性變異的豬繁殖與呼吸綜合征病毒[5-6]。2009年在河南某發(fā)病豬場采集病料,實(shí)驗(yàn)室病原檢測后確診為豬繁殖與呼吸綜合征病毒。為了研究分離的HLJ-09的致病力,進(jìn)行人工攻毒試驗(yàn),觀察攻毒后的豬臨床癥狀變化,再從微觀角度深入的觀察分析該毒株引起試驗(yàn)豬各器官組織病理變化,同時(shí)在電子顯微鏡下觀察該毒株的形態(tài)及大小,并與馬國文、歐德淵、馬春霞等人報(bào)道的病理學(xué)變化進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物 7只60日齡的SPF豬,經(jīng)血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測,豬瘟、圓環(huán)病毒、細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征、偽狂犬病等病原和抗體均為陰性。

1.2 毒株 PRRSV HLJ-09株,本實(shí)驗(yàn)室2009年利用MARC-145細(xì)胞自豬高熱綜合征發(fā)病豬分離、鑒定(另文報(bào)道)。

1.3 動物接種與觀察 隨機(jī)選取其中的5頭豬,每頭豬接種PRRSV H LJ-09株病毒液3 mL(F4病毒含量為：10-6.4 TCID50/0.1 mL),其中滴鼻2 mL,肌肉注射1 mL,其余兩頭作為對照。

接種后,每天測定體溫,并觀察其臨床癥狀,剖檢發(fā)病豬或頻死期的豬,觀察病變及采取組織樣品。

1.4 組織切片的制備 剖檢接毒后的發(fā)病豬或頻死期的豬 ,采取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、小腸、腸系膜淋巴結(jié)等,放入戊二醛固定液中固定48 h,常規(guī)包埋、切片(5μm),H.E.染色,OLYMPUS CX31光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 電鏡標(biāo)本的制備 瀕死期豬剖殺后立即取出部分肺組織修切為1 mm3大小的組織塊,經(jīng)0.1 mol/L磷酸緩沖液配制的4%戊二醛和1%鋨酸雙重固定,梯度丙酮脫水,環(huán)氧樹膠包埋。超薄切片,厚約為 50 nm,醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙重染色,GEOL-1230透射電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 臨床及剖檢病理變化 臨床表現(xiàn)：攻毒后,豬體溫升高,于攻毒后4 d體溫高于40℃,6 d后體溫高于 41℃,分別于攻毒后 6、8、9、11、12 d 死亡 ;攻毒后,豬開始出現(xiàn)扎窩,眼角有膿性分泌物,食欲減退或廢絕,拉稀,呼吸困難,身上有出血斑,耳朵發(fā)紺,豬體消瘦,死亡前有劃水樣神經(jīng)癥狀。對照組正常。

剖檢：肺臟有肉變,腸道有出血,淋巴結(jié)腫大,脾臟有出血點(diǎn)、梗死,心包有積液,腎臟有出血點(diǎn)。對照組正常。

2.2 組織病理學(xué)觀察 在顯微鏡的檢查發(fā)現(xiàn),心、肝、脾、肺、腎、腦、淋巴結(jié)、腸等發(fā)生程度不同的組織病理學(xué)變化,而對照組一切正常。具體如下：

脾臟(圖1)：大量淋巴細(xì)胞壞死后殘留大片細(xì)胞碎片,局部白髓基本消失,出血,含鐵血黃素沉著(實(shí)心箭頭)。

淋巴結(jié)(圖2)：大量淋巴細(xì)胞壞死排空,呈星空樣變(實(shí)心箭頭),可見多量細(xì)胞碎片。

腎臟(圖3)：腎小管上皮細(xì)胞變性壞死、脫落,有些腎小管中可見蛋白管型(實(shí)心箭頭)。

心肌(圖4)：心肌纖維可見出血(實(shí)心箭頭)。

肺臟(圖5)：肺泡壁極度增厚,間質(zhì)及肺泡中可見大量炎性細(xì)胞浸潤,嚴(yán)重充血、淤血。具有豬繁殖與呼吸綜合征的典型病理變化特征,如肺臟的間質(zhì)性肺炎(實(shí)心箭頭)。

小腸(圖6)：絨毛之間充滿大量漿液性分泌物,杯狀細(xì)胞增多(實(shí)心箭頭),黏膜上皮細(xì)胞變性壞死,固有層有少量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(空心箭頭)。

肝(圖7)：大量肝細(xì)胞變性壞死,中央靜脈淤血(空心箭頭),匯管區(qū)可見淋巴細(xì)胞浸潤(實(shí)心箭頭)。

腦(圖8)：腦的小靜脈、毛細(xì)血管等均充血、淤血,灰質(zhì)彌散性受損,神經(jīng)細(xì)胞空泡化,在較多的腦組織中能見“嗜神經(jīng)”現(xiàn)象(實(shí)心箭頭)。神經(jīng)細(xì)胞水腫、壞死。有的有膠質(zhì)性結(jié)節(jié)存在。

2.3 電鏡觀察 在電鏡下觀察到肺泡細(xì)胞胞漿內(nèi)兩個(gè)PRRSV粒子,橢圓形,大小為55 nm左右(見圖 9、10)。

3 討論

組織病理學(xué)損害是病原體直接導(dǎo)致宿主死亡的原因。那么變異的PRRSV引起被感染豬的高死亡率是否與其引起的病理學(xué)變化相關(guān)呢?

關(guān)于PRRSV引起的豬病理學(xué)變化已有相關(guān)報(bào)道。Joan Plana[7]、Polo[8]等分別對人工及自然感染PRRSV仔豬的組織樣本經(jīng)光學(xué)和電子顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn),感染仔豬肺組織病變在大多數(shù)病例廣泛存在且呈現(xiàn)該病的特征性病變,有時(shí)在心、腎、淋巴結(jié)、腦、肝等器官也發(fā)生程度不同的組織學(xué)病變。馬國文[9]等則較為細(xì)致的報(bào)道豬感染PRRSV引起的多種組織的病理變化。組織病理學(xué)觀察表明,PRRSV導(dǎo)致心臟血循環(huán)障礙和心肌細(xì)胞損害,進(jìn)一步引起這些組織和細(xì)胞的變性,最終導(dǎo)致了心臟功能降低,心力衰竭。病毒隨著血液循環(huán)透過血腦屏障侵入腦血管的內(nèi)皮細(xì)胞引起廣泛性的血管炎,致使靜脈血管擴(kuò)張、內(nèi)皮細(xì)胞腫脹或毛細(xì)血管中形成血栓,可引起神經(jīng)細(xì)胞變性、出血、壞死及膠質(zhì)細(xì)胞增生;對全身淋巴結(jié)和脾的損傷.也因其含有豐富的血管和巨噬細(xì)胞而比較嚴(yán)重,病毒在巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并破壞其結(jié)構(gòu)同時(shí)又引起廣泛性的血管炎和造成其他組織的破壞,從而形成脾廣泛性的壞死和淋巴結(jié)的嚴(yán)重破環(huán),致使免疫系統(tǒng)遭受嚴(yán)重?fù)p傷,這些變化是相繼發(fā)生的,機(jī)體最終因?yàn)樾呐K、肺臟、腦等各個(gè)器官的衰竭、免疫功能的喪失而造成死亡。

本試驗(yàn)中,我們利用分離到的變異PRRSV感染SPF豬,并對感染豬進(jìn)行剖檢,對病變組織進(jìn)行了免疫組化分析及電鏡觀察。電鏡結(jié)果顯示：病毒粒子的大小55nm,這一結(jié)果符合前人報(bào)道的50～64 nm,病毒粒子形態(tài)大小與前人一致。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)變異的PRRSV引起的各個(gè)組織的病理變化除具有典型的PRRS的癥狀外,與以前的報(bào)道[10-11]相比,各個(gè)組織和器官的病理變化要嚴(yán)重得多,如最不容易受到侵害的腦組織出現(xiàn)了病毒性腦炎的數(shù)個(gè)典型性病變,如出血、血栓形成和袖套現(xiàn)象等典型的病理變化。另外,在試驗(yàn)中心肌的變化也較為典型,心肌出血和淋巴細(xì)胞浸潤在組織切片中隨處可見,這可能與變異的PRRSV引起的高熱有關(guān)系(體溫高達(dá)41℃)。

在本次的試驗(yàn)結(jié)果看,PRRSV感染后對肺組織的損傷最為嚴(yán)重,肺泡毛細(xì)血管充血,肺泡內(nèi)充滿漿液性滲出物,以及數(shù)量不等的炎性細(xì)胞;肺泡中隔被彌散性的炎性細(xì)胞浸潤,有的擠壓肺泡,造成肺泡體積減少;有的肺泡擴(kuò)張,肺泡壁斷裂;血管中有血栓形成。小葉間質(zhì)水腫、壞死,以及存在炎性細(xì)胞浸潤。呼吸性細(xì)支氣管上皮細(xì)胞脫落。這些損傷導(dǎo)致了肺臟呼吸功能的減弱并逐步喪失呼吸功能,導(dǎo)致豬只呼吸困難,最后因呼吸困難而死亡;肺臟的毛細(xì)血管內(nèi)微血栓和血栓的形成,導(dǎo)致對肺臟供血出現(xiàn)障礙,肺臟得不到氧和營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng),進(jìn)一步引起肺臟呼吸功能的衰竭;同時(shí)肺臟的毛細(xì)血管內(nèi)微血栓和血栓的形成,引起氧和二氧化碳的交換障礙,導(dǎo)致機(jī)體的各個(gè)組織和器官得不到氧氣而引起機(jī)體功能的衰退,導(dǎo)致多系統(tǒng)的衰竭,進(jìn)一步導(dǎo)致豬的死亡。從這一點(diǎn)上也可以解釋變異的PRRSV引起這么高的死亡率機(jī)理。

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