雞柔嫩艾美耳球蟲3-1E和CDPK雙抗原DNA疫苗的免疫保護效果觀察

徐守振,汪 明

(1.青島農業大學動物科技學院,山東 青島 266109;2.中國農業大學動物醫學院,北京 海淀 100193)

雞球蟲病(coccidiosis of chickens)是一種嚴重危害養禽業的常見寄生蟲病。由于雞球蟲活苗存在安全性和使用不便等缺點,因此尋找一種更安全、穩定和高效的新型疫苗成為亟待解決的問題。DNA疫苗具有制備簡單、可持續誘導體液及細胞免疫反應等優點,近年來成為雞球蟲疫苗研究的熱點[1]。研究發現針對雞球蟲單一保護性抗原的DNA疫苗不具備完全的免疫保護[2-3],研制含多個保護性抗原的多價DNA疫苗可能是提高保護效果的策略之一。

本試驗將E.tenella 3-1E和CDPK兩基因融合構建了雙抗原DNA疫苗,研究其免疫保護效果。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 1日齡AA肉雞,購自北京華都肉雞有限公司。

1.2 蟲株和質粒 E.tenella GS敏感蟲株、真核載體proVAX、PK-15細胞為青島農業大學寄生蟲教研室保存。pGEX-C原核質粒和pro E真核質粒為試驗前期構建。

1.3 主要試劑 限制性內切酶Eco RⅠ、XhaⅠ、XbaⅠ、AMV反轉錄試劑盒、DNA連接試劑盒、DNA回收純化試劑盒,為寶生物工程(大連)有限公司產品。EndoFree Plasmid Maxi Kit,QIAGEN公司產品。脂質體轉染試劑盒(LipofectamineTM),Invitrogen公司產品。

1.4 引物設計 根據E.tenella 3-1E和CDPK基因序列及SOE-PCR引物設計原理,設計4條引物如 下 。 P3:5′-CCGGAAT TCATGGGTGAAGAGGCTGATAC-3′,P10:5′-ACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGAAGCCGCC CTGG TACAG-3′,P9:5′-GGT TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGG TGGCGGA TCGA TGCCGGCAGCGTCCAAGTCAG-3′,P6:5′-TGCTCTAGA CTACGCCGCGGTA TCTCCGCAC-3′,兩基因序列間 linker1:5′-GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG-3′,引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.5 融合基因擴增 以pro E為模板,P3、P10引物擴增 3-1E-linker1,條件:94℃5 min,94℃1 min,58℃1 min,72℃1 min,30個循環;72℃10 min。以pGEX-C為模板,P 9、P 6引物擴增linker1-CDPK,條件:94℃5 min,94℃1 min,64℃1 min,72℃1.5 min,72℃10 min,30個循環。各取1μL回收純化的兩片段作模板,P 3、P6引物擴增3-1E/CDPK(EC)融合基因,條件:94℃5 min,94℃1 min,58℃1 min,72℃2 min,3個循環;94℃1 min,60℃1 min,72℃2 min,3個循環;94℃1 min,62℃1 min,72℃2 min,3個循環;94℃1 min,64℃1 min,72℃2 min,20個循環;72℃10 min。

1.6 真核質粒構建與鑒定 將EC融合基因、pGEXC、proVAX 分別用Eco RⅠ+XbaⅠ雙酶切,連接、轉化及酶切鑒定均按常規方法操作,鑒定正確的陽性克隆命名為proEC和proC。無內毒素的proC和proEC質粒體外轉染PK-15細胞,轉染后30 h用間接免疫熒光試驗(IFAT)檢測重組質粒中目的蛋白表達情況,首抗為兔抗rIEC重組蛋白抗體(1∶100),二抗為羊抗兔FITC標記抗體(1∶200)。

1.7 動物分組與處理 5日齡AA肉雞隨機分為空白對照組、攻蟲對照組、proVAX組、proE組、proC組和 pro EC組;7日齡,首次免疫 porVAX、pro E、pro C和pro EC(50μg/只);14日齡,加強免疫1次;21日齡,稱重,感染5×104個 E.tenella GS株孢子化卵囊;28日齡,稱重、剖殺。

1.8 淋巴細胞轉化試驗 27日齡,心臟采血 2 mL/只,按常規方法做淋巴細胞轉化試驗(M TT法),用特異刺激抗原rIEC和非特異刺激抗原ConA分別刺激分離的淋巴細胞,計算刺激指數SI=待測孔OD值/空白對照孔OD值。

1.9 血清抗體效價檢測 13、20、27日齡,翅靜脈采血,分離血清,間接ELISA檢測血清抗體效價,包被抗原為rIEC(1μg/孔),二抗為羊抗兔HRP-IgG(1∶1000)。

1.10 免疫保護效果評價 28日齡,稱重、剖檢,計算相對增重率、盲腸內容物克糞便卵囊數(OPG)。

1.11 數據處理 采用SPSS 12.0軟件分析各組間差異。

2 結果

2.1 真核質粒的構建與鑒定 用Eco RⅠ+XbaⅠ對proC和proEC雙酶切后釋放出1500 bp和2000 bp的目的片段,用Eco RⅠ+XhaⅠ對proE雙酶切釋放出 500 bp的目的片段(見圖 1)。將proE、proC、proEC、proVAX 分別轉染PK-15細胞,熒光顯微鏡下可見proE、proC和pro EC轉染的細胞漿出現特異黃綠熒光,轉染pro VAX的無特異熒光,表明構建的重組質粒正確。

圖1 重組質粒的雙酶切鑒定

2.2 淋巴細胞轉化 攻蟲感染7 d后,ConA刺激后proEC組SI與其他各組差異顯著(P＜0.05);rIEC刺激后,proEC組SI除與proE組差異不顯著外與其他各組差異均顯著(見圖2),proEC組SI均最高。

圖2 DNA疫苗免疫后淋巴細胞轉化水平變化

圖3 DNA疫苗免疫后抗體水平變化

2.3 血清抗體效價 各疫苗組抗體水平均隨免疫次數增加而緩慢提高(見圖3)。首免及二免后1周,proC組抗體水平均低于其他疫苗組且差異顯著(P＜0.05)。二免后1周,pro EC組高于其他各組且差異顯著(P＜0.05)。感染后1周,proEC組抗體水平最高且與其他各組差異顯著(P＜0.05),proE與pro C組間差異不顯著(P＞0.05)。

2.4 免疫保護效果 由表1可見,疫苗組均可提高相對增重、降低卵囊產量,pro E組相對增重最高(87.39%),且與proC組和proEC組差異顯著(P＜0.05),而proEC組相對增重低于pro E組和proC組。proEC組OPG最低,與proE組和proC組差異不顯著(P＞0.05),proC組與proE組OPG差異也不顯著(P＞0.05)。

3 討論

雞球蟲屬于真核生物,寄生性原蟲,其生活史復雜,基因組較大,抗原基因構成復雜,目前大多數含單一抗原的雞球蟲DNA疫苗免疫保護效果均不理想 。先前我們研究發現,用含E.tenella3-1E和雞IFN-γ基因的融合質粒pro IE免疫雞后能獲得比單價pro I和 proE更強的免疫保護,說明細胞因子IFN-γ與雞球蟲3-1E抗原基因共表達可增強3-1E DNA疫苗的免疫保護力。因此,研制含多種保護性抗原的雞球蟲多價DNA疫苗預期可產生較好的保護。

表1 DNA疫苗免疫保護效果觀察

本試驗構建了含E.tenella子孢子表面抗原3-1E和CDPK的雙價DNA疫苗攻蟲,免疫后發現雙價pro EC較單價proE和proC能進一步降低卵囊產量,表現出一定的雙抗原融合表達的協同保護優點,與周建民(2005)的研究結果基本一致[4]。為增強疫苗的保護效果本試驗選用proVAX真核表達載體,其具有CMV啟動子、BGH poly A和卡那霉素抗性基因,并攜帶有協助抗原蛋白進入分泌途徑的人絨毛膜促性腺激素信號肽序列。此外,試驗采用SOE-PCR技術通過在兩基因間加入(GGGGS)315個具有良好柔順性和折疊性的接頭序列將兩基因融合,盡可能不影響3-1E和CDPK的天然結構,確保表達的兩抗原表位間不發生互相屏蔽。

本試驗雞球蟲DNA疫苗誘導細胞免疫的能力強于誘導體液免疫能力,說明雞球蟲感染真正產生免疫保護作用的細胞免疫,而體液免疫的作用很小。攻蟲感染后1周,除相對增重率外,proEC組淋巴細胞轉化能力、抗體水平和卵囊下降率在各組中均為最高,四者間沒有呈現出完全一致的關系,說明雞球蟲DNA疫苗的免疫保護機制十分復雜,仍需進一步研究。

[1]吳紹強,蔣金書,劉群,等.雞球蟲疫苗研究進展[J].畜牧獸醫學報,2005,36(1):1-5.

[2]徐守振,潘保良.雞IFN-γ與雞柔嫩艾美耳球蟲3-1E抗原共表達DNA疫苗的免疫保護性研究[J].中國獸醫雜志,2010,46(9):5-7.

[3]Song K D,Lillehoj H S,Choi K D,etal.A DNA vaccine encoding a conserved Eimeria protein induces protective immu nity against live E imeria acervu lina challenge[J].Vaccine,2000,19:243-252.

[4]周建民.雞球蟲3-1E和CDPK基因工程苗的研制及其免疫保護效果[D].北京:中國農業大學,2005.