巨型艾美耳球蟲gam82基因核酸疫苗的構(gòu)建與免疫原性分析

彭 昊,許金俊,劉丹丹,李建梅,陶建平

(揚州大學獸醫(yī)學院,江蘇 揚州 225009)

雞球蟲病(coccidiosis of chickens)是一種嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的寄生蟲病,目前該病的防治主要依賴藥物,但由于球蟲耐藥性的不斷增強,以及藥物殘留肉蛋危害人體健康,迫使人們將目光從藥物防治轉(zhuǎn)向免疫預(yù)防。商品化的新型亞單位疫苗Cox-Abic是由巨型艾美耳球蟲(E.maxima)的配子體抗原研制而成的,國外大量實際生產(chǎn)應(yīng)用表明,免疫后球蟲卵囊產(chǎn)量下降50%～80%,可用于球蟲病的控制[1]。但存在生產(chǎn)工藝復雜,費用高等缺陷。核酸疫苗是把編碼與免疫原相關(guān)的外源基因克隆到真核表達載體上,然后將重組的質(zhì)粒DNA直接注射到動物體內(nèi),使外源基因在動物體內(nèi)表達,產(chǎn)生的抗原激活機體的免疫系統(tǒng),引發(fā)免疫反應(yīng)[2],從而達到預(yù)防和治療疾病的目的。本試驗選擇巨型艾美耳球蟲NT株配子體gam82基因為疫苗候選抗原基因,以pcDNA3.1為真核表達載體構(gòu)建成核酸疫苗,用淋巴細胞增殖試驗和ELISA方法來評價核酸疫苗免疫后雞體的細胞免疫與體液免疫水平。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株與蟲株 宿主菌大腸桿菌DH5與表達載體pcDNA3.1均由本室保存;含gam82基因的重組質(zhì)粒p GEM-T-gam82由本室構(gòu)建。巨型艾美耳球蟲NT株,由本室建種并保存。

1.2 試驗動物 黃羽肉雞,購自中國農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所育種中心,出殼后即運回實驗室,飼養(yǎng)在經(jīng)5%氨水和火焰消毒的環(huán)境與籠具中。

1.3 主要試劑 T 4 DNA連接酶為Promega公司產(chǎn)品;1 kb DNA Marker、高保真Taq DNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;QIAquick瓊脂糖回收試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品;辣根過氧化物酶(H RP)標記的羊抗雞IgG為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;DAB顯色試劑盒為武漢博士德生物有限公司產(chǎn)品。

1.4 引物設(shè)計及合成 根據(jù)本室克隆的巨型艾美耳球蟲N T株配子體gam82基因的完整編碼區(qū)序列和pcDNA3.1酶切位點序列設(shè)計1對引物:上游引物 P1:5′-CCCAAGCTTA TGACGCGTGCGGCAGCGCT-3′,含Hin dⅢ酶切位點和3個保護性堿基 ;下游引物 P2:5′-CGGAATTCTTAG TTGTATGTT TCCCATACAG-3′,含 Eco RI酶切位點和 3個保護性堿基。P1與P 2間橫跨gam82基因編碼區(qū),預(yù)計擴增片段長度為1791 bp。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.5 PCR擴增 以重組質(zhì)粒pGEM-T-gam82為模板進行PCR擴增:在PCR管中依次加入超純水37 μL、10×PCR 緩沖液5μL、模板1μL、10 mmol/L dN TP 1μL 、引物P1和P 2(50 pmol/L)各1 μL、25 mmol/L MgCl23μL、高保真 Taq DN A聚合酶1μL,混勻后進行PCR反應(yīng)。PCR循環(huán)條件:95℃預(yù)變性4 min;94℃變性40 s,58℃退火40 s,72℃延伸2 min,共30個循環(huán);最后 72℃延伸 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5μL產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 PCR回收產(chǎn)物經(jīng)過Eco RⅠ和Hin dⅢ雙酶切和1%瓊脂糖凝膠電泳后,用QIAquick瓊脂糖核酸回收試劑盒回收,同時對pcDNA3.1質(zhì)粒進行Eco RⅠ和 Hin dⅢ雙酶切,回收線性載體片段與目的基因以摩爾比1∶5于16℃連接過夜。連接產(chǎn)物按常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,通過Amp抗性與Eco RⅠ和Hin dⅢ雙酶切篩選陽性質(zhì)粒。挑取含插入片段的陽性重組質(zhì)粒,接種半固體LB培養(yǎng)基,培養(yǎng)后直接寄送寶生物工程(大連)有限公司進行測序,以驗證PCR產(chǎn)物的特異性和重組質(zhì)粒的閱讀框架的正確性。

1.7 核酸疫苗的免疫原性研究 將6日齡雛雞隨機分為4組,即核酸疫苗免疫組、pcDNA3.1空質(zhì)粒組、卵囊免疫組、空白對照組,每組12羽。各注射質(zhì)粒組每雞胸肌注射25%高滲蔗糖溶液并按摩輔助擴散,再在相同位置縱向肌肉注射質(zhì)粒溶液(含質(zhì)粒100μg)。在7日齡(首免前)、14日齡(二免前)、21日齡時,分別在每組中隨機取4只雞,無菌心臟采血2 m L,其中1 mL用肝素抗凝后分離淋巴細胞,進行T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗,另1 m L血液凝固后吸取血清,用于抗體檢測。評價核酸疫苗免疫后雞的細胞免疫與體液免疫水平。(1)M TT法檢測 T淋巴細胞活性:將肝素抗凝血用不含鈣、鎂的 Hank′s液1∶1稀釋后,沿管壁緩慢加入貯有4 m L淋巴細胞分離液的試管中,以3000 r/min離心30 min后,吸取淋巴細胞層轉(zhuǎn)10 mL離心管中,再加入5倍體積不含鈣、鎂的Hank′s液洗滌。洗滌2次后對淋巴細胞進行計數(shù),并用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋淋巴細胞至1×107個/m L備用。在96孔培養(yǎng)板第1排各孔中分別加50μL培養(yǎng)基做對照,從第2排開始各孔加入10μL ConA溶液、100μL待測淋巴細胞懸液,混勻。每個樣品做3個重復。將培養(yǎng)板置CO2培養(yǎng)箱,37℃培養(yǎng)66 h。隨后加樣孔每孔吸棄70 μL上清液,加入0.5%MT T溶液 10μL,混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h,每孔再加入100μL DMSO、振蕩5 min后,用酶標儀測定各孔的OD570值。(2)間接ELISA檢測血清抗體水平:具體步驟如下:按常規(guī)方法分離血清。以純化復性的pGEX-6p-1-gam82-Y抗原[3]包被 ELISA板4℃過夜→洗板,用100μL含1%小牛血清白蛋白的封閉液封閉,37℃溫育2 h→加入 100μL稀釋后的待檢血清 37℃溫育2 h→洗板,加入HRP標記的羊抗雞IgG(37℃溫育2 h)→洗板加入新配底物緩沖液(OPD-H2 O2),37℃溫育 15 min→顯色后加入 50μL終止液(2 mol/L H2 SO4)→酶標儀測定OD490值。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增結(jié)果 以含E.maxima NT株配子體基因gam82完整ORF片段的質(zhì)粒pGEM-T-gam82 DN A為模板,采用設(shè)計的 1對引物,對gam82基因編碼區(qū)進行了擴增,大小與預(yù)計相符(圖1)。

圖1 PCR產(chǎn)物

2.2 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果 將PCR產(chǎn)物與pcDNA3.1質(zhì)粒分別用Eco RⅠ和 Hin dⅢ雙酶切,回收后按常規(guī)連接,轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α,通過Ampicillin抗性和雙酶切篩選到陽性重組質(zhì)粒,命名為pcDNA-gam82。pcDNA-gam82用Eco RⅠ和 Hin dⅢ雙酶切,出現(xiàn)一條約5.4 kb的載體片段和一條1800 bp左右的目的片段,大小與預(yù)計相符(圖2)。

2.3 T淋巴細胞活性 各試驗組雞的T淋巴細胞增殖水平及變化見表1。在試驗前各組雞的T淋巴細胞增殖水平相近。免疫后第1周,pcDNA-gam82組的T淋巴細胞增殖水平較未免疫組對照組和空質(zhì)粒組的要高,相比差異顯著,但增殖水平與卵囊免疫組相比要低,兩者間有顯著差異。2次免疫后1周的T淋巴細胞增殖水平在各組間的比較情況與第1周的相似。

圖2 重組表達質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果

2.4 血清抗體水平 間接ELISA法測定的各試驗組雞的抗體水平見表2。在試驗前各組雞的抗體水平相近。免疫后第1周,pcDNA-gam82組的抗體水平較未免疫組對照組和空質(zhì)粒組的要高,相比差異顯著,與卵囊免疫組相比要低,但兩者間差異不顯著。在免疫后第2周,卵囊免疫組抗體水平升到最高,與pcDNA3.1-gam82組有顯著差異,盡管后者的抗體水平仍然比未免疫組對照組和空質(zhì)粒組的要高。這與Lillehoj[4]發(fā)現(xiàn)球蟲刺激血清中IgG產(chǎn)生的抗體通常可在免疫后一周內(nèi)檢測到,并在第8～14天達到最高水平并能抵抗更多球蟲感染的結(jié)論相一致。

表1 各試驗組雞T淋巴細胞活性(OD570)

表2 免疫對抗體水平的影響(OD490)

3 小結(jié)與討論

巨型艾美耳球蟲配子體主要抗原基因gam82進行體外克隆表達方面的研究報道很少,其原因可能是該基因序列較長,且所含大腸桿菌稀有密碼子甚至是串聯(lián)稀有密碼子較多,用經(jīng)濟性最好的原核表達較困難。Belli[4]用原核表達載體進行全長基因表達,但表達量極低,甚至在SDS-PAGE電泳后不能用考馬斯亮藍染色檢測到目的條帶。作者也多次試圖用原核表達載體對該基因進行全長表達,但未能成功[3]。本試驗以已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEM-T-gam82為模板,以pcDNA3.1為真核表達載體,成功構(gòu)建了gam82基因的真核表達質(zhì)粒,免疫雞后能誘發(fā)特異性的體液免疫與細胞免疫,但免疫水平較活卵囊免疫要差。從免疫水平的變化來看,首免一周后體液免疫與細胞免疫水平就顯著升高,二免后進一步升高。這與Lillehoj[5]發(fā)現(xiàn)球蟲刺激血清中IgG產(chǎn)生的抗體通常可在免疫后一周內(nèi)檢測到,并在第8到14天達到最高水平并能抵抗更多球蟲感染的結(jié)論相一致。

有關(guān)DNA疫苗構(gòu)建后表達情況的檢測,傳統(tǒng)的方法是轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞,然后用多種方法檢測表達情況[6]。本試驗通過檢測pcDNA-gam82重組質(zhì)粒注射雞體后的細胞免疫水平和體液免疫水平變化,與非免疫組及注射空質(zhì)粒組對照,來直接檢測所構(gòu)建疫苗在靶動物中是否具有良好的免疫原性,這種方法能較好的反映疫苗在靶動物中所引起的免疫反應(yīng),有利于疫苗的進一步研究和開發(fā)。本試驗顯示免疫后雞體內(nèi)T淋巴細胞活性及抗體水平與非免疫組相比能有顯著提高,這為后續(xù)的核酸疫苗的動物免疫保護試驗提供了可靠依據(jù)。

[1]Sharman P A,Smith N C,Wallach M G,et a l.Chasing the golden egg:vaccination against poultry coccidiosis[J].Parasite Immun ol,2010,32(8):590-598.

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[3]彭昊,陶建平,許金俊,等.巨型艾美球蟲配子體gam82基因的克隆表達與免疫原性分析[J].中國獸醫(yī)學報,2010,30(9):1203-1207.

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