益生素雛雞新城疫疫苗免疫后局部黏膜組織T淋巴細(xì)胞數(shù)量變化

呂曉萍,趙良友,于學(xué)武,鄭世民

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心,黑龍江 哈爾濱 150040;3.遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,遼寧 沈陽(yáng) 110164)

益生素是指通過攝入適量從而對(duì)宿主產(chǎn)生有益作用的活菌[1]。益生素不僅可通過消化道發(fā)揮有益作用;還可外用于同樣存在固有菌群的泌尿系統(tǒng)和皮膚。益生素的主要功能包括:保持正常菌群,對(duì)抗感染、抑制癌癥和刺激免疫系統(tǒng)[2]。同時(shí),除具有調(diào)節(jié)正常菌群達(dá)到促進(jìn)健康作用外,還具有免疫調(diào)節(jié)作用,增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[3]。隨著養(yǎng)殖業(yè)的大規(guī)模發(fā)展,飼養(yǎng)者為了治療動(dòng)物疾病而濫用抗生素,導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)致病菌產(chǎn)生耐藥性,無法控制某些疾病的發(fā)展和蔓延。為改變這一現(xiàn)狀,人們著力尋找能夠替代抗生素的天然添加劑,以減少動(dòng)物性食品中藥物的殘留。目前研究和使用最多的是各種益生素。益生素作為免疫增加劑、抗生素的替代劑和動(dòng)物性食品的增重劑廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)。本試驗(yàn)旨在通過對(duì)雛雞局部免疫組織T淋巴細(xì)胞數(shù)量變化的研究,從細(xì)胞水平上檢測(cè)局部黏膜組織細(xì)胞免疫功能變化,揭示雛雞飼喂益生素、益生素與ND疫苗聯(lián)合應(yīng)用局部黏膜組織細(xì)胞免疫的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 1日齡艾維因雛雞100只,雌雄各半,購(gòu)自哈爾濱某孵化場(chǎng)。經(jīng)雞傳染性囊病、雞馬立克病和雞傳染性支氣管炎等抗體檢測(cè)均為陰性。

1.2 產(chǎn)酶益生素 山東華爾康生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)批號(hào)為飼添字(2007)11178號(hào),按產(chǎn)品說明使用。

1.3 新城疫疫苗 LaSota弱毒苗(Ⅳ系),哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司,批號(hào)為200861,按產(chǎn)品說明使用。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 100只雛雞隨機(jī)分為益生素組(簡(jiǎn)稱P組)、ND疫苗免疫組(簡(jiǎn)稱V組)、益生素ND免疫組(簡(jiǎn)稱P+V組)和對(duì)照組(簡(jiǎn)稱N組)4組,每組25只雛雞,分別做如下處理:

P組雛雞分別于1日齡和18日齡連續(xù)灌服生理鹽水3 d,1次/d,并分別于10日齡和21日齡經(jīng)點(diǎn)眼、滴鼻免疫新城疫弱毒苗,其中21日齡疫苗免疫劑量為10日齡的2倍。

P+V組雛雞除將V組的灌服生理鹽水改為灌服益生素外,其他處理與V組相同。

N組雛雞分別于1日齡和18日齡連續(xù)灌服生理鹽水3 d,1次/d,為正常對(duì)照。

1.5 試驗(yàn)材料的采取及處理 N、P、V、P+V組雛雞分別于疫苗首次免疫后第0、7、14、28天和第42天,每組隨機(jī)抽取5只雛雞,心臟采血處死,快速采取哈德爾氏腺、盲腸扁桃體、十二指腸和回腸派伊爾結(jié)固定于4℃預(yù)冷的4%甲醛蔗糖緩沖液中,冰箱4℃固定24 h。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法 (1)切片制備:固定組織經(jīng)流水沖洗后,分別于 70%、80%、90%、100%Ⅰ和100%Ⅱ丙酮逐級(jí)脫水(時(shí)間依組織塊大小從30 min～60 min)、二甲苯透明、常規(guī)石蠟浸透、包埋和制片。(2)T細(xì)胞檢測(cè):盲腸扁桃體、哈德爾氏腺、十二指腸和回腸派伊爾結(jié) T細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)應(yīng)用ANAE染色法。(3)鏡檢計(jì)數(shù):參考 Timo romppanen格點(diǎn)計(jì)數(shù)法[4],油鏡檢查免疫組織特定區(qū)域5個(gè)視野中的T細(xì)胞數(shù)量,以×103細(xì)胞/mm2表示。

1.7 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,比較各組間差異。

2 結(jié)果

2.1 益生素雛雞ND疫苗接種后盲腸扁桃體T細(xì)胞數(shù)量變化

2.1.1 益生素雛雞ND疫苗接種后盲腸扁桃體彌散區(qū)T細(xì)胞數(shù)量變化 雛雞接種ND疫苗后,益生素ND免疫雛雞盲腸扁桃體彌散區(qū) T細(xì)胞數(shù)量分別于第14天、第7～14天和第7～28天明顯高于ND疫苗單獨(dú)免疫雛雞、益生素雛雞和對(duì)照雛雞(P＜0.05或P＜0.01);益生素雛雞和ND疫苗單獨(dú)免疫雛雞上述被檢指標(biāo)于免疫后7～28 d明顯高于對(duì)照雛雞(P＜0.05或P＜0.01);ND疫苗單獨(dú)免疫雛雞又于7～14 d高于益生素雛雞(P＜0.01);其余未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(表1)。

表1 益生素ND免疫雛雞扁桃體彌散區(qū)T細(xì)胞數(shù)量變化 (×103個(gè)/mm2)

2.1.2 益生素雛雞ND疫苗接種后盲腸扁桃體淋巴小結(jié)T細(xì)胞數(shù)量變化 雛雞接種ND疫苗后,益生素ND免疫雛雞盲腸扁桃體淋巴小結(jié)T細(xì)胞數(shù)量分別于第14天、第 7～14在和第7～28天明顯高于ND疫苗單獨(dú)免疫雛雞、益生素雛雞和對(duì)照雛雞(P＜0.05或P＜0.01);益生素雛雞和ND疫苗單獨(dú)免疫雛雞上述被檢指標(biāo)于7～28 d顯著或極顯著高于對(duì)照雛雞(P＜0.05或P＜0.01);ND疫苗單獨(dú)免疫雛雞于免疫后7～17 d多于益生素雛雞(P＜0.01);其余未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(表2)。

2.2 益生素雛雞ND疫苗接種后哈德爾氏腺T細(xì)胞數(shù)量變化

2.2.1 益生素雛雞ND疫苗接種后哈德爾氏腺分泌管周圍T細(xì)胞數(shù)量變化 雛雞接種ND疫苗后,益生素ND免疫雛雞哈德爾氏腺分泌管周圍T細(xì)胞數(shù)量分別于第14天和第7～28天較益生素雛雞和對(duì)照雛雞顯著增多(P＜0.05或P＜0.01),益生素雛雞和ND疫苗單獨(dú)免疫雛雞分別于第14天和第7～28天明顯高于對(duì)照雛雞(P＜0.05或 P＜0.01),ND疫苗單獨(dú)免疫雛雞于免疫后第14天極顯著高于益生素雛雞(P＜0.01);其余未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(表3)。

表2 益生素ND免疫雛雞盲腸扁桃體淋巴小結(jié)T細(xì)胞數(shù)量變化 (×103個(gè)/mm2)

表3 益生素ND免疫雛雞哈德爾氏腺分泌管周圍T細(xì)胞數(shù)量變化 (×103個(gè)/mm2)

2.2.2 益生素雛雞ND疫苗接種后哈德爾氏腺集合管周圍T細(xì)胞數(shù)量變化 雛雞接種ND疫苗后,益生素ND免疫雛雞哈德爾氏腺集合管周圍T細(xì)胞數(shù)量于第14天極顯著高于益生素雛雞和對(duì)照雛雞(P＜0.01);ND疫苗單獨(dú)免疫雛雞分別于免疫后第14天和第14～28天明顯高于益生素雛雞和對(duì)照雛雞(P＜0.05或P＜0.01),其余未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(表4)。

表4 益生素ND免疫雛雞哈德爾氏腺集合管T細(xì)胞數(shù)量變化 (×103個(gè)/mm2)

2.3 益生素雛雞ND疫苗接種后腸派伊爾結(jié)T細(xì)胞數(shù)量變化

2.3.1 益生素雛雞ND疫苗接種后十二指腸派伊爾結(jié)T細(xì)胞數(shù)量變化 雛雞接種ND疫苗后,益生素ND免疫雛雞十二指腸派伊爾結(jié)T細(xì)胞數(shù)量分別于第14天和第14～28天明顯高于益生素雛雞和對(duì)照雛雞(P＜0.05或P＜0.01);ND疫苗單獨(dú)免疫雛雞分別于免疫后第14天和第7～14天顯著或極顯著高于益生素雛雞和對(duì)照雛雞(P＜0.05或P＜0.01),其余未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(表5)。

表5 益生素ND免疫雛雞十二指腸派伊爾結(jié)T細(xì)胞數(shù)量變化 (×103個(gè)/mm2)

2.3.2 益生素雛雞ND疫苗接種后回腸派伊爾結(jié)T細(xì)胞數(shù)量變化 雛雞接種 ND疫苗后,益生素ND免疫雛雞回腸派伊爾結(jié) T細(xì)胞數(shù)量分別于第14天和第7～28天明顯高于益生素雛雞和對(duì)照雛雞(P＜0.05或P＜0.01);ND疫苗單獨(dú)免疫雛雞分別于免疫后第14天和第7～14天明顯高于益生素雛雞和對(duì)照雛雞(P＜0.01),其余未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(表6)。

3 討論

益生素是良好的免疫增強(qiáng)劑,可提高機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫,增強(qiáng)機(jī)體抵抗力[5]。在動(dòng)物飼料中添加益生素,可促進(jìn)機(jī)體免疫器官發(fā)育,提高T、B細(xì)胞數(shù)量,增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng),還可激活巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等活性細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,增強(qiáng)機(jī)體的抗病力[6]。研究發(fā)現(xiàn)[7],雙歧桿菌可促進(jìn)免疫活性細(xì)胞表面IL-6、IL-10和IFN-α等細(xì)胞因子的表達(dá);應(yīng)用乳酸桿菌和芽孢桿菌后,動(dòng)物腸道黏膜底層細(xì)胞增加,淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞,自然殺傷性細(xì)胞的吞噬功能增強(qiáng),分泌多種細(xì)胞因子,如IL-4、IL-6和IL-10等可促進(jìn)SIgA合成,使腸道免疫屏障作用增強(qiáng),從而提高機(jī)體抵抗感染能力[8]。

表6 益生素ND免疫雛雞回腸派伊爾結(jié)T細(xì)胞數(shù)量變化 (×103個(gè)/mm2)

試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),雛雞接種ND疫苗后,益生素ND免疫雛雞和ND疫苗單獨(dú)免疫雛雞的哈德爾氏腺、盲腸扁桃體和回腸派伊爾結(jié) TANAE+細(xì)胞數(shù)量分別于免疫后第14天、第7～14天和第7～28天明顯高于未接種疫苗的益生素雛雞和對(duì)照雛雞(P＜0.05或P＜0.01)。表明ND疫苗接種提高了機(jī)體消化道局部黏膜的細(xì)胞免疫水平。產(chǎn)生上述變化的原因可能是:弱毒疫苗作為抗原進(jìn)入機(jī)體后,首先被以巨噬細(xì)胞為主的抗原提呈細(xì)胞捕獲,一方面對(duì)其加工處理,濃集抗原決定簇于細(xì)胞表面;另一方面分泌細(xì)胞因子IL-1,在MHCⅡ類分子作用下,輔助性Th細(xì)胞(CD4+)識(shí)別并接受相應(yīng)抗原決定簇和IL-1刺激,活化淋巴母細(xì)胞,使T細(xì)胞數(shù)量增加。致敏的Th細(xì)胞表達(dá)IL-2受體,同時(shí)釋放多種細(xì)胞因子,如 IFN-γ、IL-6、IL-10和 IL-13等,參與細(xì)胞免疫。未接種疫苗的雛雞,因沒有受到外源性抗原(弱毒疫苗)的刺激,機(jī)體局部免疫組織的T細(xì)胞并不致敏活化,不會(huì)大量增殖和分化,T細(xì)胞數(shù)量較接種了ND疫苗的雛雞沒有明顯的增加趨勢(shì)。

試驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn),ND疫苗免疫42 d,益生素雛雞上述免疫組織的TANAE+細(xì)胞數(shù)量不同程度高于未服用益生素的對(duì)照雛雞,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。表明益生素可促進(jìn)免疫器官發(fā)育和激發(fā)雛雞局部黏膜組織的細(xì)胞免疫。產(chǎn)生上述變化的主要原因可能是:(1)益生素作為活菌制劑在雛雞腸道表面定植與繁殖,當(dāng)其增殖至一定數(shù)量時(shí),可刺激機(jī)體免疫組織發(fā)育和免疫應(yīng)答。(2)益生素在腸道內(nèi)繁殖,不斷合成免疫器官組織發(fā)育不可缺少的維生素和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。(3)益生素自身組成成分,如脂多糖、肽聚糖和DNA等大分子釋放到機(jī)體腸道內(nèi),直接刺激機(jī)體免疫器官發(fā)育和激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答。(4)益生素作為免疫增強(qiáng)劑作用于機(jī)體,活化了腸黏膜內(nèi)相關(guān)淋巴組織,使腸道黏膜底層細(xì)胞增加,呈現(xiàn)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn),增強(qiáng)機(jī)體局部免疫功能。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),益生素ND聯(lián)合應(yīng)用雛雞的局部黏膜免疫組織TANAE+細(xì)胞數(shù)量均不同程度高于ND疫苗單獨(dú)免疫雛雞。其中益生素ND聯(lián)合應(yīng)用雛雞盲腸扁桃體在免疫后第14天顯著高于ND單獨(dú)免疫雛雞(P＜0.05)。表明益生素與ND疫苗聯(lián)合使用,增強(qiáng)了雛雞局部黏膜的細(xì)胞免疫功能和對(duì)ND疫苗的免疫應(yīng)答。產(chǎn)生這種變化的原因可能是:益生素中含有芽孢桿菌、雙歧桿菌和乳酸菌等,它們和弱毒疫苗抗原一樣,作為外源性物質(zhì),共同刺激機(jī)體的局部黏膜免疫系統(tǒng),使機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng),也增強(qiáng)了機(jī)體對(duì)ND疫苗的免疫應(yīng)答。

病原體侵染機(jī)體時(shí),首先要突破機(jī)體與外界環(huán)境的屏障-黏膜表面。ND局部免疫部位也是NDV入侵門戶,因此,通過黏膜途徑激發(fā)的黏膜免疫在ND免疫中具有重要地位。益生素與ND疫苗聯(lián)合應(yīng)用提高ND疫苗的局部細(xì)胞免疫水平,在ND防治中有嚴(yán)重意義。

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