[4（-4-氟苯基）-6-異丙基-2（-N-甲基-N-甲磺酰基氨基）嘧啶-5-基]甲醇含量測定和有關物質檢查

謝春燕，徐新軍，劉群娣，閆李麗，謝曉玲（.中山大學藥學院，廣州市50006；.廣州中一藥業有限公司，廣州市 50000）

瑞舒伐他汀鈣（Rosuvastatin calcium）為新型的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG CoA）還原酶抑制劑[1]，是第7個進入市場的他汀類藥物，是迄今為止最強效的降脂藥物，被譽為“超級他汀”[2]，主要用于治療高脂血癥和高膽固醇血癥[3]。

[4-（4-氟苯基）-6-異丙基-2-（N-甲基-N-甲磺酰基氨基）嘧啶-5-基]甲醇（以下中文名均簡稱為瑞舒伐他汀中間體Ⅵ，英文名為Rosuvastatin intermediateⅥ），是中山大學藥學院合成瑞舒伐他汀鈣改進工藝時的第6步反應的產物中間體[2]。藥物合成中間體是合成原料藥的重要物質，其質量直接決定了原料藥和最終成品的質量和療效，因此有必要對藥物合成中間體進行質量控制。在合成瑞舒伐他汀鈣時，該中間體反應時技術難度較高，比較容易引入雜質，而其他中間體合成過程相對比較簡單，容易獲得高純度的產品。所以該中間體的純度和雜質含量直接決定后續的合成工作與最終產品的質量，研究該中間體的含量測定方法和有關物質含量測定方法可考察合成路線是否可行。目前有關瑞舒伐他汀中間體Ⅵ質量標準研究的文獻報道僅有其殘留溶劑測定[4]，本文建立了瑞舒伐他汀中間體Ⅵ含量測定及其有關物質檢查的高效液相色譜（HPLC）分析方法，對有效地控制瑞舒伐他汀鈣成品的質量具有十分重要的意義。

瑞舒伐他汀中間體Ⅵ及瑞舒伐他汀鈣的化學結構式見圖1。

1 儀器與試藥

1525型HPLC儀、2996型二極管陣列檢測器、717型自動進樣器（美國Waters公司）；Mettler Toledo AG285十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

圖1 瑞舒伐他汀中間體Ⅵ和瑞舒伐他汀鈣的結構式Fig 1 Formula structure of rosuvastatin intermediateⅥand rosuvastatin calcium

瑞舒伐他汀中間體Ⅵ對照品（批號：081229，含量：99.88%）；瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品（批號：090109、090110、090111）；瑞舒伐他汀中間體 Ⅰ（批號：081213）、中間體Ⅱ（批號：081216）、中間體Ⅲ（批號：081218）、中間體Ⅳ（批號：081221）、中間體Ⅴ（批號：081225）、中間體Ⅶ（批號：081228）均由中山大學藥學院制備；乙腈為色譜純，甲醇、磷酸二氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉等均為分析純，水為超純水。

2 瑞舒伐他汀中間體Ⅵ含量測定

2.1 色譜條件

色譜柱：Grace-Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.025 mol·L－1磷酸二氫鈉溶液（57∶43）；檢測波長：235 nm；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 系統適用性試驗

取瑞舒伐他汀中間體Ⅵ對照品適量，加甲醇-水（80∶20）溶解制備為濃度約為500μg·mL－1的對照品溶液；取瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品適量，加甲醇-水（80∶20）溶解制備成濃度約為500μg·mL－1的樣品溶液；另取瑞舒伐他汀合成中間體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ適量，分別加甲醇-水（80∶20）制備成濃度約為250μg·mL－1的溶液；取瑞舒伐他汀中間體Ⅱ適量，制備為濃度約為40μg·mL－1的溶液。分別取上述瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品溶液和瑞舒伐他汀中間體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ溶液適量，混合均勻，得瑞舒伐他汀中間體Ⅰ～Ⅶ混合樣品溶液。

取瑞舒伐他汀中間體Ⅰ～Ⅶ混合樣品溶液、對照品溶液、瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品溶液進樣分析，結果，以瑞舒伐他汀中間體Ⅵ峰計理論板數不低于3 000，各峰分離度大于1.5。二極管陣列檢測器檢查主峰色譜純度角為0.038，閾值為0.307，前者小于后者，表明純度符合規定。色譜見圖2。

圖2 系統適用性高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of system suitability

2.3 專屬性試驗

取瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品分別進行酸（1 mol·L－1的鹽酸甲醇溶液）、堿（1 mol·L－1的氫氧化鈉甲醇溶液）、氧化（3%的雙氧水）、高溫（取樣品固體少量，電爐加熱至約200℃）、光照（紅外照射7 h，光照強度約2 000 lx）破壞試驗，各破壞后樣品分別加入甲醇-水（80∶20）稀釋為500 μg·mL－1的供試液。分別精密吸取上述供試液各5μL，注入液相色譜儀，記錄色譜至主峰保留時間的2.5倍。結果，酸、堿、氧化、高溫及光照破壞后的降解產物與主成分有很好分離，詳見圖3。

圖3 破壞試驗高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms of destruction tests

2.4 線性范圍

取濃度為260.79 μg·mL－1的對照品溶液，分別進樣5、10、15、20、25、30μL。以濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得線性回歸方程為y＝994 891x－111 953（r＝0.999 9），瑞舒伐他汀中間體Ⅵ檢測濃度的線性范圍為65.20～391.18 μg·mL－1。

2.5 回收率試驗

精密量取5 mL已知濃度（256.76μg·mL－1）的樣品溶液（批號：090111）3份于25 mL容量瓶中，分別加入4、5、6 mL對照品溶液（濃度為260.79 μg·mL－1），加甲醇-水（80∶20）稀釋至刻度，平行操作2份。按“2.1”項下條件測定，低、中、高3個濃度回收率分別為99.16%、98.73%、100.59%，RSD分別為0.59%、0.67%、1.06%。

2.6 重復性試驗

進樣重復性試驗：取對照品溶液重復進樣6次，每次20μL，記錄峰面積，RSD為0.23%。

樣品測定的重復性：取瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品（批號：090110）6份，精密稱定，按“2.2”項下樣品溶液制備方法操作，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算含量平均值為99.48%，RSD為0.69%。

2.7 樣品溶液穩定性試驗

取同一份瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品溶液（批號：090109，濃度：251.58 μg·mL－1），分別于制備后8 h內每隔一段時間進樣1次，記錄峰面積。結果，RSD為0.53%，表明樣品溶液在8 h內穩定。

2.8 樣品含量測定

稱取3批瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品（批號：090109、090110、090111）各2份，精密稱定，制備為樣品溶液。按“2.1”項下色譜條件，同時取對照品溶液和樣品溶液注入色譜儀，按外標法計算含量，結果見表1。

3 有關物質檢查

3.1 色譜條件

色譜柱：Grace-Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動

表1 樣品中主成分和有關物質含量測定結果Tab 1 Content determination of main component and its related substances in samples

3.2 有關物質檢查方法

取瑞舒伐他汀中間體Ⅵ對照品適量，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加甲醇-水（80∶20）溶解，得濃度為253.90 μg·mL－1的對照品溶液A。精密量取1 mL對照品溶液A，至100 mL容量瓶中，加甲醇-水（80∶20）稀釋得濃度為2.54 μg·mL－1的對照品溶液B（即1%的對照品溶液A）。取瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品62.5 mg，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加甲醇-水（80∶20）溶解得濃度約為1 250 μg·mL－1的樣品貯備溶液。精密量取5 mL樣品貯備溶液至25 mL容量瓶中，加甲醇-水（80∶20）稀釋得濃度約為250μg·mL－1的樣品溶液。取對照品溶液B、樣品溶液分別進樣20 μL。

3.3 線性關系考察

取濃度為2.371 μg·mL－1的對照品溶液（相當于樣品溶液的1%），分別進樣2、5、10、20、40 μL。以濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得線性回歸方程為y＝51 293x－3 642.4（r＝0.999 5），表明有關物質的檢測濃度線性范圍為0.24～4.75 μg·mL－1。

3.4 定量限和檢測限

根據定量限和檢測限試驗方法進行操作，結果有關物質的檢測限為195.8 ng·mL－1，定量限為587.5 ng·mL－1。

3.5 重復性試驗

稱取瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品（批號：090110）6份，精密稱定，按“3.2”項下操作，照“3.1”項下色譜條件測定并計算有關物質的含量。結果，有關物質含量分別為0.17%、0.18%、0.17%、0.18%、0.17%、0.18%，RSD為0.20%。

3.6 樣品中有關物質含量測定

稱取瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品（批號：090109、090110、090111）每批各2份，精密稱定，按“3.1”和“3.2”項下方法操作，采用主成分自身稀釋對照法[5]計算有關物質的含量，結果見表1。

4 討論

4.1 色譜條件的選擇

4.1.1 波長選擇。采用二極管陣列檢測器對瑞舒伐他汀中間體Ⅵ在200～400 nm波長內進行光譜掃描，發現在235 nm波長處有強吸收峰，所以選擇235 nm作為含量測定的檢測波長。經掃描，樣品在220 nm波長處雜質峰有明顯吸收，且基線噪音不大，故選用220 nm作為有關物質含量測定的檢測波長。

4.1.2 流動相選擇。大多數瑞舒伐他汀合成中間體呈弱酸性，考慮用緩沖鹽作為流動相，參考相同他汀類藥物測定的色譜條件，決定采用0.025 mol·L－1的磷酸二氫鈉溶液[6]（pH＝4.7）。首先以乙腈-0.025 mol·L－1磷酸二氫鈉（40∶60）為流動相，測定瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品溶液，結果主峰保留時間過長；后調整乙腈為60%，結果主成分在9.6 min出峰；另選擇甲醇-水（70∶30）為流動相，取瑞舒伐他汀中間體Ⅰ～Ⅶ混合樣品溶液進樣，結果峰形重疊而且拖尾；又采用乙腈-0.025 mol·L－1磷酸二氫鈉（60∶40），取混合樣品溶液進樣，結果在9～10 min時有3個峰明顯重疊；最后流動相調整為乙腈-0.025 mol·L－1磷酸二氫鈉（57∶43），結果混合樣品中各峰分離較好，主峰與相鄰峰分離度大于1.5，峰形好，故選用乙腈-0.025 mol·L－1磷酸二氫鈉（57∶43）為流動相進行測定。

4.2 主成分自身稀釋對照法

本品無相應雜質的對照品，且雜質含量低，不適合用面積歸一化法計算雜質含量。主成分自身稀釋對照法是通過稀釋樣品溶液作為雜質對照計算雜質含量，適用于無法得到雜質對照品的化合物的有關物質含量測定，故本文選用此法進行測定。通過考察瑞舒伐他汀中間體Ⅵ樣品色譜圖雜質峰情況，將雜質限量定為1%，以樣品溶液的1%作為對照溶液計算樣品雜質的含量（計算雜質含量時，任何小于主峰面積0.05倍的峰忽略不計）。

[1] 李玉霞，江 珊.瑞舒伐他汀的研究進展[J].心血管病學進展，2010，31（5）：585.

[2] 邵 飛，孫笑賓，魏啟華.瑞舒伐他汀中間體的合成工藝改進[J].精細化工，2006，23（2）：192.

[3] 邱 暢，溫預關，張 明，等.LC-MS/MS法檢測人血漿中瑞舒伐他汀的濃度[J].今日藥學，2010，20（4）：13.

[4] 謝曉玲，謝春燕，萬金志，等.氣相色譜法測定[4-（4-氟苯基）-6-異丙基-2-（N-甲基-N-甲磺酰基氨基）嘧啶-5-基]甲醇的殘留溶劑[J].中國藥房，2010，21（45）：4 294.

[5] 魏嘉陵，林暢偉.用加校正因子的主成分自身對照法測定苯扎貝特中雜質氯苯酪胺的含量[J].藥物分析雜志，2006，26（12）：1 848.

[6] 王學軍，許振良，馮建立，等.反相高效液相色譜法測定辛伐他汀及其有關物質洛伐他汀的含量[J].中國現代應用藥學雜志，2007，24（5）：383.