RP-HPLC 法測定小飛蓬總黃酮中野黃芩苷、槲皮素和木犀草素的含量Δ

葉豆丹，嚴銘銘，趙 爽，邵 帥，萬志強，展 月（長春中醫藥大學，長春市 130117）

小飛蓬Erigeron canadensisL.為菊科飛蓬屬的一年生草本植物，別名小白酒草、加拿大蓬、小蒸草、魚膽草等，具有清熱利濕、解毒消腫的功效，可治腸炎、痢疾、傳染性肝炎、膽囊炎、瘡癤腫毒、中耳炎、眼結膜炎[1]。本課題組已從該中藥材中分離出黃酮類化合物近20種，生物堿類化合物近10種，其他類化合物20余種[2]。目前，本課題組對小飛蓬總黃酮進行了分離純化，總黃酮含量已達76.52%，藥效學實驗表明其對小鼠肉瘤（S180）具有明顯抑制作用。本試驗針對其中所含有的3種成分——野黃芩苷、槲皮素和木犀草素，建立了相應的含量測定方法，確立了3種成分的含量，以為有效控制小飛蓬總黃酮的質量提供依據。

1 儀器與試藥

Agilent1100高效液相色譜（HPLC）儀，包括Agilent化學工作站、DAD檢測器、在線脫氣機、四元高壓梯度泵（美國Agilent公司）；KQ-250B超聲清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）。

槲皮素（批號：100081-200406）、木犀草素（批號：111520-200504）與野黃芩苷（批號：110842-200504）對照品均購自中國藥品生物制品檢定所；小飛蓬采自吉林省長白縣，經長春中醫藥大學姜大成教授鑒定為菊科飛蓬屬植物小飛蓬E.canadensisL.；小飛蓬總黃酮（長春中醫藥大學研發中心自制，批號：090517，含量：76.52%）；甲醇為色譜純，冰醋酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 混合對照品貯備液的制備

精密稱取野黃芩苷、槲皮素、木犀草素對照品各6.5 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度均為0.65 mg·mL-1的野黃芩苷、槲皮素與木犀草素混合對照品貯備液。

2.2 供試品溶液的制備

取小飛蓬總黃酮50 mg，加甲醇20 mL，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）溶解并定容至25 mL，經0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.5%冰醋酸水溶液（B），梯度洗脫（0～12.00 min，A∶B＝40 ∶60；12.01～30.00 min，A∶B＝62 ∶38；30.01～50.00 min，A∶B＝85∶15）；檢測波長：360 nm；流速：1 mL·min-1；柱溫：30℃[3，4]。分別精密吸取混合對照品貯備液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖。色譜見圖1。

2.4 線性關系考察

精密吸取上述混合對照品貯備液0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成含野黃芩苷、木犀草素與槲皮素分別均為0.052、0.065、0.078、0.091、0.104、0.117 mg·mL-1的混合對照品溶液，分別吸取10 μL注入液相色譜儀，照上述色譜條件測定峰面積。以峰面積積分值（Y）為縱坐標，對照品進樣量（X）為橫坐標，制備標準曲線，得槲皮素的回歸方程為Y＝1 081X+16.062（r＝0.999 9，n＝6）；野黃芩苷的回歸方程為Y＝68.361X－396.85（r＝0.999 9，n＝6）；木犀草素的回歸方程為Y＝68.999X－276.54（r＝0.999 9，n＝6）。結果表明，3種成分的進樣量均在0.52～1.17 μg范圍內與各自峰面積積分值呈良好的線性關系。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 精密度試驗

精密吸取上述混合對照品貯備液10 μL，重復進樣5次，測定峰面積。結果，野黃芩苷、槲皮素、木犀草素的RSD分別為1.10%、1.94%、1.47%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

精密稱取同一小飛蓬總黃酮樣品6份，每份50.0 mg，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，各吸取10 μL注入液相色譜儀，測定峰面積。結果，野黃芩苷、槲皮素、木犀草素的RSD分別為1.56%、1.36%、1.04%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗

于0、1、4、8、12、24 h分別精密吸取室溫放置的同一供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積。結果，野黃芩苷、槲皮素、木犀草素的RSD分別為1.18%、1.29%、1.16%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品6份，每份約20.0 mg（野黃芩苷、槲皮素、木犀草素含量分別為3.127%、7.707%、6.718%），分別精密加入野黃芩苷、槲皮素與木犀草素對照品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，依含量測定方法操作，進樣測定，計算加樣回收率，結果分別見表1～表3。

表1 野黃芩苷的加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1Results of recovery tests of scutellarin（n＝6）

表2 槲皮素的加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 2Results of recovery tests of querceti（nn＝6）

表3 木犀草素的加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 3Results of recovery tests of luteolin（n＝6）

2.9 樣品含量測定

分別精密稱取5批小飛蓬總黃酮樣品適量，照“2.2”項下方法分別制備供試品溶液，取10 μL注入液相色譜儀，依法各測定3次，計算樣品中野黃芩苷、槲皮素和木犀草素的含量，結果見表4。

表4 樣品含量測定結果（%，n＝3）Tab 4Results of content determination of sample（s%，n＝3）

3 討論

筆者曾分別測定槲皮素、木犀草素、野黃芩苷對照品與樣品的最大紫外吸收波長，結果發現槲皮素與木犀草素對照品分別為368 nm與349 nm，而野黃芩苷對照品在285 nm及337 nm波長處各有一最大吸收峰，但樣品在360 nm波長附近有一較強吸收峰，故將檢測波長設在360 nm波長處。

采用梯度洗脫方式，以甲醇-0.5%冰醋酸水溶液為流動相，節省了流動相，并大大縮短了測試時間，取得了較為滿意的結果。

綜上，本試驗所建反相HPLC法簡便、快速、準確，可為有效控制小飛蓬總黃酮的質量提供依據。

[1] 張 麗，李彩芳，李曉梅，等.加拿大蓬α-葡萄糖苷酶抑制作用[J].河南大學學報（醫學版），2008，27（4）：39.

[2] 邵 帥，嚴銘銘，畢勝男，等.小飛蓬化學成分的研究[J].中國藥學雜志，2009，44（14）：1 053.

[3] 張 潔，顧政一，何承輝，等.HPLC法同時測定新疆一枝蒿中木犀草素和一枝蒿酮酸的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2009，15（4）：1.

[4] 龍風榮，孫 敏.HPLC測定熱淋清膠囊中槲皮素的含量[J].中成藥，2007，29（4）：613.