注射用肌萎靈細菌內毒素檢查方法的研究Δ

鄭亞杰，賈繼明，王貴金，劉興國，蔡艷，宋劍（河北以嶺醫藥研究院，石家莊市050035）

注射用肌萎靈是由人參、淫羊藿藥材經加工制備而成的中藥注射用無菌粉末制劑，具有治療運動神經元疾病（肌萎縮側索硬化、進行性脊肌萎縮、進行性延髓麻痹、原發性側索硬化）、進行性肌營養不良、先天性肌病等疾病所致的肌肉萎縮及重癥肌無力的作用[1]。注射用肌萎靈質量標準中對注射劑采用家兔法進行熱原檢查，但家兔法進行熱原檢查操作復雜、時間長。根據細菌內毒素檢查方法（鱟試劑，TAL）具有靈敏度高、快速、準確、操作簡便等優點[2，3]，按《中國藥典》“中藥注射劑安全性檢查法應用指導原則”及“細菌內毒素檢查法”[4]，筆者建立了注射用肌萎靈細菌內毒素檢查方法，以確保臨床用藥安全。

1 儀器與試藥

XW-01定時可調速旋渦混勻器（上海醫大儀器廠）；YJ-875B垂直凈化工作臺（上海陽光實驗儀器有限公司）；DK-S26電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）。

注射用肌萎靈（本院自制，規格：每支820 mg，批號：jwl090203、jwl090301、jwl090302）；細菌內毒素工作標準品（CES，效價為每支10 EU，批號：090301）、TAL（靈敏度0.25 EU·mL-1，批號：080506）、細菌內毒素檢查用水（WBET，規格：每支10 mL，批號：080301，內毒素含量＜0.015 EU·mL-1）均購于廈門市鱟試劑實驗廠有限公司；TAL（靈敏度0.25 EU·mL-1，批號：08120912，福州新北生化工業有限公司；靈敏度0.25 EU·mL-1，批號：0902250，湛江博康海洋生物有限公司）。

2 方法與結果

2.1 內毒素限值（L）的確定

根據公式L＝K/M（式中K為按規定的給藥途徑，人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑K＝5 EU·kg-1·h-1；M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，人均按60 kg計算），根據使用說明書，本品成人日用量為2支（每支820 mg，溶解于250 mL注射用溶媒中），注射時間為2 h。因此，M＝（2×820）/（60×2）＝41/3≈13.7 mg·kg-1·h-1，則L＝5/13.7＝0.366 EU·mg-1。

2.2 TAL靈敏度復核試驗

將CSE用WBET溶解后，于旋渦混合器上混合15 min，然后制成濃度為0.5、0.25、0.125、0.0626 EU·mL-1的稀釋液，按照2010年版《中國藥典》項下[4]試驗進行（λ為TAL的標示靈敏度，為0.25 EU·mL-1），結果見表1。

表1 TAL靈敏度復核試驗結果Tab 1 Verification results of the sensitivity of TAL

由表1可知，3個廠家的3批TAL經CSE檢查，其靈敏度的測定值（λc）均位于0.5 λ～2 λ范圍內，均符合規定，可用于細菌內毒素檢查。

2.3 樣品最小有效稀釋濃度（c）的確定

根據最大有效稀釋倍數公式MVD＝cL/λ。本品為注射用無菌粉末，MVD＝1，則c＝λ/L。本試驗中L為 0.366 EU·mg-1。因此，本試驗中c＝λ/L＝0.25/0.366＝0.68 mg·mL-1。

2.4 干擾預試驗

將供試品初始溶液（820 mg/6 mL≈137 mg·mL-1，相當于c為0.68 mg·mL-1的約200倍），用WBET分別稀釋2、40、80、120、160、200倍，使濃度約為67、3.3、1.7、1.1、0.8、0.7 mg·mL-1的溶液，每一個稀釋倍數做2支供試品管（NPC）和2支供試品2λ濃度的CSE供試品陽性對照管（PPC）；另取2支CSE加WBET制成2λ的溶液作為陽性對照管（PC），2支TAL加WBET作為陰性對照管（NC）。按2010年版《中國藥典》（一部）項下[4]進行試驗，結果見表2。

表2 TAL的干擾預試驗結果Tab 2 Results of the preliminary interference test of TAL

由表2可知，樣品在上述試驗稀釋濃度對檢測均無干擾，故選擇供試品初始濃度稀釋40倍，經干擾試驗進一步驗證。

2.5 干擾試驗

用 WBET 將 3批供試品（jwl090203、jwl090301、jwl 090302）分別稀釋為初始濃度的40倍，作為供試品溶液（A）；取供試品稀釋液及WBET分別將CES稀釋為0.5、0.25、0.125、0.062 5 EU·mL-1的溶液作為干擾試驗溶液（B）和陽性對照溶液（C）；取WBET，作為陰性對照溶液（D）。照2010年版《中國藥典》（一部）項下[4]方法，取3個廠家的TAL進行試驗，結果見表3。

由表3可知，Es在0.5 λ～2.0 λ，且Et在0.5Es～2.0Es范圍內，3個廠家的TAL試驗結果基本一致，則供試品溶液在初始濃度稀釋40倍時對細菌內毒素檢測不產生干擾。

2.6 細菌內毒素檢查

取3批樣品用WBET稀釋至初始濃度的40倍，作為供試品溶液；取3個廠家靈敏度為0.25 EU·mL-1的TAL，按照2010年版《中國藥典》（一部）項下[4]進行試驗。結果，3批樣品經3個廠家TAL檢測均符合規定。TAL檢查結果見表4。

3 討論

由于本品為注射用無菌粉末，溶解時本身會占用較大體積[5，6]，因此在試驗過程中考慮到樣品本身溶解后體積，結合質量標準檢查項下試驗，采用將樣品先用6 mLWBET溶解，再進行稀釋，避免了由于樣品濃度不準確導致對細菌內毒素的寬松判定可能造成的臨床使用不安全。

干擾預試驗結果表明，試驗考察的各稀釋濃度均無干擾。由于中藥注射劑成分較復雜，干擾因素較多，不同廠家不同批次的TAL亦存在一定差異，故在試驗中選取相對較大的稀釋倍數（40倍），以確保供試品濃度不對檢測產生干擾。

表3 TAL的干擾試驗結果Tab 3 Results of the interference test of TAL

表4 TAL檢查結果Tab 4 Results of TALtest

經過3個不同廠家的TAL檢測，3批制劑均符合規定，檢測結果與家兔法結果一致，表明TAL進行細菌內毒素檢查可用于注射用肌萎靈的質量控制。因其操作簡單、靈敏快捷、準確可靠，可以大大提高檢測效率，降低試驗成本，值得在注射用肌萎靈批量生產檢測過程中推廣。

[1] 吳以嶺.一種治療肌肉萎縮及重癥肌無力的藥物及其制備方法[P].中國專利：200410096779.8，2007-12-12.

[2] 鄭 霞，趙毓梅，劉 春.葛根素注射液細菌內毒素檢查[J].中國藥房，2007，18（16）：1 254.

[3] 陳德堅.枯痔注射液細菌內毒素檢查法的建立[J].中國藥房，2009，20（9）：699.

[4] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄131-132、附錄88-89.

[5] 朱方美，高建平.對阿沙吉樂粉劑溶解后所占體積的分析[J].基層醫學論壇，2007，11（1）：94.

[6] 羅素華，蒲 麗，鄧小紅.對需作過敏試驗粉劑藥物溶解后所占體積的研究[J].中國實用護理雜志，2005，21（10）：43.