散結(jié)明目顆粒的制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

張艷君，馬婷玉，聶繼紅，王萍，劉兆龍（.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院，烏魯木齊市83000；.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊市 830000）

散結(jié)明目方是由新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院眼科李全智主任醫(yī)師創(chuàng)立的驗方，臨床長期用于治療由于目絡(luò)瘀阻引起的視瞻昏渺、暴盲，以及玻璃體積血和增殖性視網(wǎng)膜病變。該方具有活血祛瘀、散結(jié)明目等功效。為方便患者使用，本課題組擬將其制成顆粒劑。為全面控制制劑的內(nèi)在質(zhì)量，對方中夏枯草、赤芍、槐花、川芎等進(jìn)行定性鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法對處方中丹參的有效成分丹酚酸B進(jìn)行含量測定[1]。

1 儀器與試藥

2695HPLC儀（美國Waters公司）；AL204電子天平、AG135電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；SK3300LH超聲清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；Di-rect-QTM5超純水儀（美國Millipore公司）。

丹參、紅花、赤芍、夏枯草、莪術(shù)、三棱、水蛭、槐花、茺蔚子、昆布、川芎藥材均由新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院提供，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院副主任藥師李玲檢驗均符合2010年版《中國藥典》（一部）項下規(guī)定[2]；丹酚酸B、熊果酸、芍藥苷、蘆丁對照品和夏枯草、赤芍、槐花、川芎對照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110736-200630、110742-200516、110736-200630、 100080-200707、 120993-200604、 121093-200402、121270-200602、210918-200608）；ZTC1+1-Ⅱ天然澄清劑，包括A、B組分（天津正天成澄清技術(shù)有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 處方與制備

2.1 處方

本品處方由丹參、夏枯草、赤芍、紅花等11味中藥組成。

2.2 制備

按處方比例稱取夏枯草、赤芍等8味藥材，加入10倍量80%乙醇提取3次，每次1 h；合并3次醇提液，將醇提液濃縮至藥材與藥液比為1∶10，緩慢細(xì)流加入藥液量10%的ZTC+1-Ⅱ型天然澄清劑的B組分，邊加邊攪，置于60℃水浴中保溫1 h，再緩慢細(xì)流加入藥液量5%的ZTC+1-Ⅱ型天然澄清劑的A組分，攪勻，置于60℃水浴中保溫1 h，靜置24 h，離心2 min；濃縮干燥成干膏，干膏粉碎過80目篩，備用。

按處方比例稱取丹參、紅花、昆布3味藥材，加入20倍量水提取2次，每次0.5 h[3，4]；合并2次水提液，將水提液濃縮至藥材與藥液比為1∶4，4 000 r·min-1離心10 min；濃縮干燥成干膏，干膏粉碎過80目篩，備用。

取干膏粉量20%的莪術(shù)細(xì)粉（過80目篩）和5‰的甜菊糖苷與上述2種干膏粉混合均勻，用92%乙醇為黏合劑制粒，黏合劑加入量為40 mL·100 g-1。將制得顆粒進(jìn)行干燥，干燥溫度設(shè)定為40～60℃，干燥6 h，在干燥過程中，溫度應(yīng)逐漸升高。將干燥后聚結(jié)成塊的顆粒過14目篩整粒，即可。

3 定性鑒別

3.1 夏枯草的薄層色譜（TLC）鑒別

取3批樣品的細(xì)粉各1 g，加乙醇20 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，用石油醚（30～60℃）浸泡2次，每次15 mL（約2 min），傾去石油醚液，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液；取夏枯草對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液；另取熊果酸對照品，加乙醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作為對照品溶液；取處方中除夏枯草以外的所有藥材，按制備工藝制得陰性樣品，照供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。照TLC法[2]試驗，吸取上述4種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸（20∶5∶8∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于100℃加熱至斑點顯色清晰，分別置于日光、紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品、對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點或熒光斑點；陰性對照無干擾。夏枯草的TLC分別見圖1、圖2。

圖1 夏枯草的TLC（紫外光）Fig 1 TLC of Prunella vulgaris（ultraviolet light）

圖2 夏枯草的TLC（日光）Fig 2 TLC of P.vulgaris（sunlight）

3.2 赤芍的TLC鑒別

取3批樣品各0.5 g，加乙醇10 mL，振搖5 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇2 mL使溶解，作為供試品溶液；取赤芍對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液；取處方中除赤芍以外的所有藥材，按制備工藝制得陰性樣品，同法制成陰性對照溶液；另取芍藥苷對照品，加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。照TLC法[2]試驗，吸取上述4種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品、對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點或熒光斑點；陰性對照無干擾。赤芍的TLC見圖3。

3.3 槐花的TLC鑒別

取3批樣品的細(xì)粉各0.2 g，加甲醇5 mL，密塞，振搖10 min，濾過，濾液作為供試品溶液；取槐花對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液；取處方中除槐花以外的所有藥材，按制備工藝制得陰性對照樣品，同法制成陰性對照溶液；另取蘆丁對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照TLC法[2]試驗，吸取上述4種溶液各15 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－甲酸－水（8∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，待乙醇揮干后，分別置于日光、紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品、對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點或熒光斑點；陰性對照無干擾。槐花的TLC分別見圖4、圖5。

圖3 赤芍的TLCFig 3 TLC of Paeoniae Radix Rubra

圖4 槐花的TLC（紫外光）Fig 4 TLC of Sophora japonica（ultraviolet light）

圖5 槐花的TLC（日光）Fig 5 TLC of S.japonica（sunlight）

3.4 川芎的TLC鑒別

取3批樣品的細(xì)粉各2.9 g，置于錐形瓶中，加入20 mL乙醚，密塞，振搖稱重后回流1 h，過濾，將濾液蒸干，殘渣加入乙酸乙酯20 mL使溶解，作為供試品溶液；取川芎對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液；取處方中除川芎以外的所有藥材，按制備工藝制得陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。照TLC法[2]試驗，分別吸取上述3種溶液各15 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（9∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性對照無干擾。川芎的TLC見圖6。

圖6 川芎的TLCFig 6 TLC of Ligusticum chuanxiong

4 含量測定

4.1 色譜條件

色譜柱：SHIMADZU VP-ODS（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.2%磷酸（23.5∶76.5）；檢測波長：286 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。

4.2 方法學(xué)考察

4.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取研至細(xì)粉的樣品顆粒2 g，置于錐形瓶中，加入80%甲醇20 mL，密塞，振搖，稱重，超聲20 min，補足失重，濾紙濾過，即得。

4.2.2 對照品貯備液的制備 精密稱取丹酚酸B對照品38.75 mg，加甲醇適量溶解，并定容至25 mL量瓶中，作為對照品貯備液。

4.2.3 陰性對照試驗 按處方量精密稱取除丹參外其余10味藥材，按制備工藝制成陰性樣品，精密稱取研至細(xì)粉的陰性樣品2 g，照“4.2.1”項下方法制備成缺丹參的陰性對照溶液。在上述色譜條件下測定，結(jié)果陰性對照干擾。色譜見圖7。

圖7 高效液相色譜圖Fig 7 HPLC chromatograms

4.2.4 線性關(guān)系考察 分別吸取對照品貯備液0.2、1.0、1.8、2.6、3.4 mL，置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻濃度分別為0.062、0.310、0.558、0.806、1.054 mg·mL-1的對照品系列溶液，微孔濾膜（0.45 μm）過濾后取10 μL注入色譜儀，照上述色譜條件測定。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，檢測濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝7.763 2×10-8X+1.938 8×10-3（r＝0.999 9）。結(jié)果，丹酚酸B檢測濃度在0.062～1.054 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

4.2.5 精密度試驗 取同一對照品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄丹酚酸B的峰面積。結(jié)果，RSD＝1.61%（n＝5），表明儀器精密度良好。

4.2.6 加樣回收率試驗 取已知含量的供試品溶液（含量：0.690 1 mg·mL-1）9份，按供試品溶液中含量的80%、100%、120%加入不同量的丹酚酸B對照品溶液，制備成高、中、低濃度的各3份樣品，按“4.2.1”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定，計算加樣回收率。結(jié)果，平均回收率為100.3%，RSD＝1.52%（n＝9）。

5 討論

本試驗對處方中的所有藥味分別進(jìn)行了TLC鑒別。結(jié)果，夏枯草、赤芍、槐花、川芎的TLC鑒別斑點清晰，分離度好，陰性對照無干擾，因此列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

由于顆粒提取成分復(fù)雜，薄層層析干擾較大，在其他成分的薄層展開過程中反復(fù)出現(xiàn)以下問題：對照品斑點與供試品斑點比移值有差別，陰性有干擾；目標(biāo)斑點與其他組分斑點分離度不夠，造成斑點疊加。處方中其他成分的TLC鑒別有待進(jìn)一步研究。

研究制劑中丹酚酸B含量測定方法時，曾選用水、甲醇、乙醇等不同的溶劑進(jìn)行提取，并采用加熱回流提取和超聲提取兩種不同的方法進(jìn)行提取。結(jié)果，甲醇超聲提取簡便、快捷，且提取率較高，因此選用甲醇作為提取溶劑。筆者曾比較了不同比例的甲醇-乙腈-2%甲酸、甲醇-乙腈-1%甲酸、乙腈-0.2%磷酸等多種溶劑系統(tǒng)作為流動相，結(jié)果以乙腈-0.2%磷酸（23.5∶76.5）作為流動相，色譜圖峰形好，出峰時間適宜，分離效果較好。

[1] 楊 男，胡 明，蔣學(xué)華.國外臨床藥學(xué)服務(wù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其對我國的啟示[J].中國藥房，2009，20（7）：486.

[2] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：70、141、147、263、257、12、77、333、225、195、38、附錄34.

[3] 于沈晶，殷文廣，修志龍.丹參不同提取工藝的研究[J].中草藥，2007，38（4）：542.

[4] 聶繼紅，周 玲.復(fù)方中丹參提取工藝及含量測定的研究[J].中成藥，2007，29（6）：889.