含酚爐甘石洗劑微生物限度檢查方法學的驗證

李遼閩 曾慶莉

（1 湖北省襄陽市婦幼保健院，湖北 襄陽 441000；2 湖北省黃石市食品藥品監督檢驗所，湖北 黃石 435000）

含酚爐甘石洗劑為淡紅色懸浮液，有薄荷腦、苯酚特臭。外用止癢、輕度收斂，保護皮膚，用于濕疹、皮疹、皮膚瘙癢癥等。其成份為苯酚、爐甘石、氧化鋅、樟腦、薄荷腦等。由于本品為混懸液，又具有較強的抑菌作用，采用常規實驗方法難以除去其抑菌成分，我們采用離心沉淀集菌法[1]，取底部集菌液約2mL，按中國藥典2005年版二部相關規定[2]進行試驗，結果表明，該方法省時、易操作，適用于含酚爐甘石洗劑的微生物限度檢查。

1 儀器、試藥和菌種

1.1 生物安全柜、隔水式恒溫培養箱（30～35℃）、生化培養箱（23～28℃）、電熱干燥箱（160～250℃）、立式滅菌器、電子天平、離心沉淀器、超凈臺。

1.2 營養瓊脂、改良馬丁氏液體培養基、改良馬丁氏瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基、營養肉湯、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基、溴化十六烷三甲胺瓊脂培養基，均由北京陸橋技術有限公司生產。

1.3 稀釋劑：氯化鈉-蛋白胨緩沖液，由北京陸橋技術有限公司生產。

1.4 菌種：大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]由中國藥品生物制品檢定所提供；所有菌種均為第四代。

1.5 樣品:含酚爐甘石洗劑（批號：100305、100507、100916，100mL/瓶）襄陽市婦幼保健院制劑室。

2 方法與結果

2.1 細菌數、霉菌和酵母菌數測定方法驗證試驗

2.1.1 菌液的制備

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，35℃培養18～24h，各取1mL，分別加9mL的0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10-5～10-7，活菌數約為50～100cfu/mL，做活菌計數備用。

表1 菌落計數方法驗證結果（cfu）

接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁氏液體培養基中，25℃培養18～24h，取1mL，加9mL的0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10-5～10-7，活菌數約為50～100cfu/mL，做活菌計數備用。

接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁氏瓊脂斜面培養基中，25℃培養1周，加5mL的0.9%無菌氯化鈉溶液，洗下霉菌孢子，吸出菌液，用標準比濁管比濁。取1mL，加9mL的0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10-4，活菌數約為50～100cfu/mL，做活菌計數備用。

2.1.2 供試液的制備

吸取樣品10mL至有無菌玻璃珠的250mL三角燒瓶中，加90mL無菌的稀釋液，混勻，使成1∶10的供試液。取此液10mL，以500轉/分離心5min，取全部上清液，再以3000轉/分離心10min，棄去上清液，留底部集菌液約2mL，加稀釋劑至10mL備用。

2.1.3 回收率測定

①試驗組：取1∶10備用的供試液1mL，加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌各1mL（50～100cfu/mL），分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養基（營養瓊脂、改良馬丁氏瓊脂培養基）。每株試驗菌平行制作兩個平皿，培養24～72h觀察結果。②菌液組：除不加供試液外，其余操作同試驗組。③供試品對照組：除不加菌懸液外，其余操作同試驗組。④稀釋劑對照組：用稀釋劑取代供試液，其余操作同試驗組。

2.1.4 結果

驗證試驗至少進行3次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。（所得回收率均不低于70%）

結論：采用離心沉淀集菌法檢驗含酚爐甘石洗劑，該試驗對5種菌種的回收率均高于70%，該驗證試驗通過。結果見表1。

2.2 金黃色葡萄球菌檢查方法驗證試驗

①試驗組：取1∶10備用的供試液10mL，加入到100mL無菌的營養肉湯培養基中，加1mL金黃色葡萄球（50～100cfu/mL），35℃培養24h。取上述培養物，劃線接入甘露醇氯化鈉瓊脂培養基中35℃培養24h。②陰性菌對照組：取1∶10備用的供試液10mL，加入到100mL無菌的營養肉湯培養基中，加入1mL大腸埃希菌（50～100cfu/mL），35℃培養24h。取上述培養物，劃線接入甘露醇氯化鈉瓊脂培養基中35℃培養24h。③陽性對照組：除不加供試液外，其余操作同試驗組。④陰性對照組：用稀釋液取代供試液，不加菌液，其余操作同試驗組。

結果：陰性菌對照組未檢出陰性對照菌;試驗組檢出金黃色葡萄球;陽性對照組檢出金黃色葡萄球；陰性對照組無菌生長。

結論：根據驗證試驗結果，表明供試品可采用離心沉淀集菌法檢驗金黃色葡萄球

2.3 銅綠假單胞菌檢查方法驗證試驗

①試驗組：取1∶10備用的供試液10mL，加入到100mL無菌的膽鹽乳糖培養基中，加入1mL銅綠假單胞菌（50～100cfu/mL），35℃培養24h。取上述培養物，劃線接入溴化十六烷三甲胺瓊脂培養基中35℃培養24h。②陰性菌對照組：取1∶10備用的供試液10mL，加入到100mL無菌的膽鹽乳糖培養基中，加入1mL大腸埃希菌（50～100cfu/mL），35℃培養24h。取上述培養物，劃線接入溴化十六烷三甲胺瓊脂培養基中35℃培養24h。③陽性對照組：除不加供試液外，其余操作同試驗組。④陰性對照組：用稀釋液取代供試液，不加菌液，其余操作同試驗組。

結果：陰性菌對照組未檢出陰性對照菌;試驗組檢出銅綠假單胞菌;陽性對照組檢出銅綠假單胞菌；陰性對照組無菌生長。

結論：根據驗證試驗結果，表明供試品可采用離心沉淀集菌法檢驗銅綠假單胞菌。

3 討 論

經過試驗觀察，說明用離心沉淀集菌法處理過的供試液適合各種試驗菌的生長；供試品對照組無菌生長說明供試品中無影響試驗的雜菌；菌液組各種菌生長良好，說明該方法的實驗環境適合參加試驗的各種菌的生長；陰性對照組無菌生長，說明稀釋劑、培養基及試驗操作過程符合無菌操作的標準。試驗結果表明，采用離心沉淀集菌法能有效去除含酚爐甘石洗劑的抑菌成分，對試驗菌的生長無影響，該方法適合含酚爐甘石洗劑的微生物限度檢查。

[1] 馬緒榮,蘇德模.藥品微生物學檢驗手冊[M].北京:科學出版社,2000:60.

[2] 國家藥典委員會.中國藥典.2005.二部[S].北京:化學工業出版社,2005:附錄XI J.