細胞內外鈣在川芎嗪舒張豚鼠氣管平滑肌中的作用

許小洋 許繼德 劉筱藹

（廣州醫學院基礎學院生理教研室，廣東 廣州 510182）

在哮喘的治療中，抑制氣道平滑肌的痙攣仍然是急性期治療的關鍵[1]。近年來發現中藥川芎的提取物川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP）具有心血管保護作用[2,3]，同時還發現川芎嗪具有一定的抑制氣管平滑肌痙攣及增殖的效應[4,5]。然而，目前對川芎嗪舒張支氣管效應的詳細機制尚不明確。各種致痙物質最終作用于氣道平滑肌中由鈣離子介導的興奮－收縮耦聯機制，從而使氣道平滑肌產生痙攣。而氣道平滑肌細胞漿中的鈣來源于胞外鈣內流或肌質網的鈣釋放，川芎嗪有可能就是通過影響鈣的這兩種來源進而產生其效應的。為此，本實驗利用離體灌流的方法，探討川芎嗪舒張氣道平滑肌的效應與細胞內外鈣離子的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與試劑

Hartley豚鼠（中山大學實驗動物中心）；川芎嗪（TMP，美國Sigma公司）；EGTA 和thap sigargin（TSG，美國Sigma公司）；鹽酸異丙腎上腺素（上海禾豐制藥有限公司，批號：090703）；Krebs-Henseleit 營養液（K-H液）組成如下（mmol/L）：NaCl 120，KCl 4.5，CaCl22.5，NaHCO325，KH2PO41.2，MgSO4·7H2O 0.8，葡萄糖10.1；無鈣K-H液中去除CaCl2，加入0.1mmol/L EGTA。

1.1.2 儀器

HSS-1數字式超級恒溫浴槽（成都儀器廠），BL-420E生物信號采集處理系統（成都泰盟）。

1.2 實驗方法

1.2.1 豚鼠離體氣管環制備

健康豚鼠，雌雄不拘，200～250g，擊昏豚鼠，動脈放血致死，立即取出氣管，置K-H液中，制備成氣管螺旋條（含3個軟骨環）。將標本置37℃ K-H 液水浴槽內，通氧氣，將氣管平滑肌環靜息張力調至1.5g力（15.7×10-3N）。張力通過張力換能器輸入BL-420E生物信號采集處理系統記錄。氣管平滑肌標本在浴槽內穩定1h 后開始實驗。

1.2.2 實驗分組

TMP對離體豚鼠氣管平滑肌環的效應觀察分兩組：TMP組和空白組。TMP組分別加入10-6～10-3mol/L TMP，待其基線平穩后再加入10-6mol/L的異丙腎上腺素，以異丙腎上腺素的舒張度為100%計算各濃度TMP的舒張率。空白組則加入等量的K-H 液作為對照。

細胞內外鈣在TMP舒張氣管平滑肌中的作用觀察分有鈣K-H 液組和無鈣K-H 液組2大組。有鈣K-H 液組的實驗均在有鈣K-H 液中進行，又分為有鈣＋TMP組和有鈣＋TSG＋TMP組：前組只加入10-3mol/L TMP，后組預先加入TSG（10mmol/L）40min，再加入10-3mol/L TMP。無鈣K-H 液組的實驗均在無鈣K-H 液中進行，又分為無鈣＋TMP組和無鈣＋TSG＋TMP組：前組只加入10-3mol/L TMP，后組預先加入TSG（10mmol/L）40min，再加入10-3mol/L TMP。分別記錄靜息張力及給藥后的張力，并計算張力變化值（即差值），差值＝靜息張力－給藥后張力。

1.3 統計學處理

采用SPSS 13.0對實驗數據進行統計處理。數據以均數±標準差（±s）表示，數據的顯著性比較選用組內成對數據t檢驗或組間獨立樣本t檢驗。P＜0.05被認為有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 TMP對離體豚鼠氣管平滑肌的舒張作用

與空白組對照，TMP對離體豚鼠氣道平滑肌具有明顯的舒張作用（P＜0.01），并且呈劑量依賴性（10-6～10-3mol/L），在10-3mol/L濃度時，其舒張率與異丙腎上腺素基本相等（圖1）。

2.2 細胞外鈣在川芎嗪舒張效應中的作用

結果見表1。在有鈣K-H液中，川芎嗪可顯著舒張氣管平滑肌（P＜0.01）；用肌漿網鈣泵抑制劑TSG孵育40分鐘，以耗竭肌漿網儲存的Ca2+，此時川芎嗪仍然具有舒張氣道平滑肌的效應（P＜0.01），TSG對TMP的效應無顯著影響（P＞0.05）。

表1 細胞外鈣在川芎嗪舒張豚鼠氣管平滑肌效應中的作用(±s，10-3N)

表1 細胞外鈣在川芎嗪舒張豚鼠氣管平滑肌效應中的作用(±s，10-3N)

注：n=10；組間比較指兩組差值的組間比較

有鈣＋TMP 14.70 12.84±1.011.86±1.01 5.849 ＜0.01有鈣＋TSG＋TMP 14.70 12.43±1.322.27±1.32 5.416 ＜0.01組間比較 0.774 0.449

2.3 細胞內鈣在川芎嗪舒張效應中的作用

結果見表2。在無鈣K-H液中，川芎嗪對氣管平滑肌的舒張作用雖然也達到顯著性差異的水平（P＜0.05），但其效應較弱；而經TSG預孵后，其對氣管平滑肌無明顯舒張效應（P＞0.05），兩組間比較無顯著差異（P＞0.05）。川芎嗪在無鈣K-H液中對氣管平滑肌的舒張效應（（0.17±0.21）×10-3N）明顯比其在有鈣K-H液中的效應（（1.86±1.01）×10-3N，見表1）弱（t＝5.181，P＜0.01）。

表2 細胞內鈣在川芎嗪舒張豚鼠氣管平滑肌效應中的作用(±s，10-3N )

表2 細胞內鈣在川芎嗪舒張豚鼠氣管平滑肌效應中的作用(±s，10-3N )

注：n=10；組間比較指兩組差值的組間比較

無鈣＋TMP 14.70 14.53±0.210.17±0.212.6120.028無鈣＋TSG＋TMP 14.70 14.52±0.320.18±0.321.8220.102組間比較 0.0520.959

3 討 論

抑制氣道平滑肌痙攣是哮喘治療中的重要措施，而氣道平滑肌的痙攣與鈣離子介導的興奮-收縮耦聯機制密切相關。興奮－收縮耦聯中的重要離子Ca2+來源于胞外Ca2+內流或肌質網的Ca2+釋放。為探討川芎嗪對氣道平滑肌的作用機制是否與影響胞外Ca2+內流或肌質網Ca2+釋放有關，本實驗觀察了有Ca2+和無Ca2+環境中川芎嗪對離體豚鼠氣管平滑肌環的效應，并且利用肌質網Ca2+泵抑制劑thap sigargin（TSG）耗竭肌質網的Ca2+，以觀察其對川芎嗪氣道平滑肌作用效應的影響，從而為探討川芎嗪的作用機制提供實驗依據。

本實驗的結果顯示，川芎嗪具有舒張正常離體豚鼠氣管平滑肌的作用。其舒張效應呈劑量依賴性（10-6～10-3mol/L）。說明川芎嗪具有潛在的臨床應用價值。

在有鈣K-H液中，用肌漿網鈣泵抑制劑TSG耗竭肌漿網儲存的Ca2+，此時氣管平滑肌的舒縮狀態主要受細胞外Ca2+的影響，實驗結果顯示川芎嗪仍然具有舒張氣道平滑肌的效應，與未加TSG組的效應無顯著差異。表明川芎嗪對離體氣道平滑肌的舒張效應與肌質網Ca2+（細胞內鈣）釋放的關系不明顯，即可能主要是通過抑制細胞外Ca2+的內流而實現的。

為了進一步闡明Ca2+在川芎嗪舒張氣道平滑肌中的作用，本實驗還在無鈣K-H液中進行了觀察，此時氣管平滑肌的舒縮主要受肌質網Ca2+（細胞內鈣）的影響。結果顯示，在無鈣K-H液中，川芎嗪對氣管平滑肌雖然也有一定的舒張作用，但與其在有鈣K-H液中的作用相比明顯減弱；TSG在無鈣K-H液中對川芎嗪的效應無明顯影響。這些結果進一步提示，川芎嗪主要是影響細胞外Ca2+內流而產生舒張效應的，肌質網Ca2+（細胞內鈣）對其作用無明顯影響。有報道表明，可抑制大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞電壓依賴性鈣通道[6]，提示，川芎嗪對氣道平滑肌的舒張效應可能與抑制鈣通道有關。

綜上所述，川芎嗪可對正常豚鼠離體氣管平滑肌產生明顯舒張作用，其效應的產生可能與細胞外Ca2+內流的抑制有關。

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