順鉑納米載體體外抗腫瘤作用的比較研究

孫曉譯，梁文權

(1.浙江大學城市學院醫學與生命科學學院，浙江杭州310015;2.浙江大學藥學院，浙江杭州310058)

目前，廣泛研究和使用的親水性藥物納米載體主要有脂質體、納米粒、聚合膠束等。藥物載體的化學組成和物理結構，會通過改變藥物的釋放行為［1］、粒子表面特性、與細胞膜及其它成分的相互作用力［2］、細胞轉運途徑［3］，從而最終影響藥物的療效。面對各種可供選擇的藥物載體，如何進行合理選擇成為人們關注的問題。目前的研究多針對一種納米載體進行結構修飾或改變，但平行比較多種載體的研究少有報道。

順鉑是一種水溶性細胞周期非特異性抗腫瘤藥物，對于卵巢癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、惡性淋巴瘤、乳腺癌、頭頸部鱗癌等多種實體腫瘤均有療效［4］。但因為存在腎臟毒性、神經毒性、骨髓抑制和胃腸道反應等嚴重的毒副作用［5］，因此臨床應用受到了一定的限制。目前有許多給藥系統，如脂質體［6］、納米粒［7］、納米囊［8］等正處于研究和開發之中，以期能達到在靶部位緩慢釋放藥物、減少給藥劑量和降低藥物毒性的作用。其中研究較為成熟的是順鉑脂質體和明膠納米粒。

本研究選用順鉑作為水溶性藥物的模型藥物，以順鉑脂質體和順鉑明膠納米粒為納米載體的研究對象，通過平行的細胞攝取、消除、內吞抑制、體外抗腫瘤等實驗，比較兩種納米載體在敏感細胞A549中的轉運和抗腫瘤作用的區別與特點，為順鉑的載體選擇提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 順鉑(CDDP)購自山東齊魯制藥廠;氯丙嗪(CPZ)、細胞松弛素D(CytD)、非律平Ш(Filipin Ш)購自Sigma公司;氫化大豆磷脂(HSPC)和膽固醇由Lipoid公司提供;鉑標準液、115In標準液購自上海晶純試劑有限公司。DMEM培養基、小牛血清、胰酶和青霉素-鏈霉素雙抗試劑購于Gibico公司。

1.2 細胞株 人肺腺癌A549細胞系從中科院上海生科院購得。

1.3 順鉑脂質體及順鉑明膠納米粒的制備順鉑脂質體(CDDP-liposome)根據文獻［9］稍經修改制備。65℃攪拌下溶解20 mg順鉑于2 ml生理鹽水。250 mg HSPC和50 mg膽固醇溶于乙醇后，將其滴入順鉑溶液中攪拌，保持混懸液65℃，1 h。將脂質懸液進行探頭超聲，趁熱過0.22 μm濾膜。濾液室溫放冷，過0.45 μm濾膜除結晶藥物。濾液于透析袋(MWCO:14 kDa)室溫透析除去游離藥物。

順鉑明膠納米粒(GPs-Pt)用兩步去溶劑法制備［7］。磁力攪拌下將丙酮滴加至4%(w/v)明膠溶液(以1 mol/L鹽酸調節pH2.5)，納米粒懸液以0.2%戊二醛交聯過夜。明膠納米粒離心收集，并用水洗除有機溶劑及交聯劑。將制得的空白納米粒分散于1 mg/ml順鉑水溶液中，37℃振搖反應24 h。未結合的順鉑依上法離心、水洗去除。冷凍干燥即得。

1.4 納米載體的表征 取CDDP-liposomes和GPs-Pt，用PBS稀釋至合適濃度，激光衍射粒度分析儀測定粒徑分布和表面電位。

透析法(MWCO:14 kDa)測定順鉑納米載體的體外釋放。透析液為DMEM培養液。37℃，75次/min振搖條件下，間隔一定時間取樣。

載藥量測定:將一定量的順鉑脂質體或納米粒消解，按1.5項下處理，電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)測定含量。

1.5 Pt含量測定 取待測細胞樣本，加入115In內標液(1 μg/ml)50 μl，再加入 5 ml 65%HNO3，于120℃中消解。溶液近干時，加超純水5 ml，再加熱至近干。重復以上步驟，至棕色氣體消失，溶液透明清亮，最后用超純水定容至5 ml，ICP-MS 進樣分析。

1.6 細胞攝取與消除 細胞以5×105個/孔接種，過夜。攝取時給藥濃度20 μg/ml，孵育3 h。PBS洗滌后，加內標，按1.5項下消解細胞，用于整體細胞Pt含量測定。胞內Pt含量測定時，PBS洗滌細胞后用胰酶消化細胞，離心、洗滌并收集細胞后消解，用于ICP-MS定量。

消除實驗前，先進行細胞攝取。后以PBS洗去藥液，以新鮮培養液培養細胞，記錄該時間點為消除起點。于一定時間點，胰酶消化、收集細胞。按1.5項下處理樣品，用于胞內Pt含量測定。

1.7 內吞抑制 細胞5×105個/孔接種。含內吞抑制劑的培養液與細胞孵育30 min后，加入含藥載體(20 μg/ml CDDP)，繼續培養1 h。PBS洗滌，胰酶消化收集細胞，按照1.5項下消解細胞測定Pt濃度。各抑制劑濃度:50 mmol/L 2DG/0.05%NaN3，10 μg/ml CPZ，2 μmol/L CytD，1 μg/ml filipin Ш。低溫攝取時，細胞預先在4℃條件下放置30 min后低溫攝取1 h，其余操作同前。

1.8 細胞毒性實驗 細胞1×104個/孔接種，過夜。加入不同濃度的藥液，培養72 h后，MTT法測定細胞毒性。

1.9 統計學處理 數據以“均數±標準差”表示，采用方差分析或t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 納米載體表征 順鉑脂質體和明膠納米粒的粒徑、電位及載藥量，如表1所列。體外釋放以順鉑溶液為對照，結果顯示兩種載體72 h內藥物釋放約30%，其中脂質體的釋放較明膠納米粒更慢(72 h，P ＜0.05，圖1)。

表1 順鉑脂質體和順鉑納米粒的粒徑、電位和載藥量Table 1 Size，zeta potential and drug loading of CDDP-liposomes and GPs-Pt

圖1 順鉑脂質體和順鉑納米粒體外釋放曲線Fig.1 In vitro release of CDDP solution，CDDP liposomes and GPs-Pt

2.2 細胞攝取 經細胞攝取3 h后，納米粒組胞內和總體細胞Pt水平均顯著高于脂質體(P＜0.05)。但其胞內Pt濃度低于溶液組(圖2A)。明膠納米粒細胞膜吸附能力強，約占細胞總量的80%。

2.3 內吞途徑 低溫攝取顯著降低了胞內藥物含量，CPZ顯著抑制了明膠納米粒和脂質體的細胞攝取(P＜0.05)。Filipin Ш的存在對順鉑溶液和兩種納米載體的細胞攝取均無影響。CytD減小了納米粒和脂質體的細胞內化，脂質體組胞內Pt含量減小了45%，納米粒組減小了15%(圖2B)。

2.4 細胞消除 順鉑的細胞消除動力學曲線見圖3A。脂質體組4 h內約15%的藥物被清除出細胞，順鉑溶液消除比例相似。納米粒組胞內Pt含量下降最多(50%)，各時間點的消除比例較脂質體組均有顯著性差異(P＜0.05)(圖3B)。根據一室模型計算得各藥動學參數如表2。脂質體組的消除速率常數小于納米粒，k約為后者的1/3。脂質體的胞內滯留能力大，MRT約為20 h，與溶液組接近。

2.5 細胞毒性實驗結果 兩種空白載體在實驗濃度條件下，均未發現明顯的細胞毒性。載藥顆粒的抗增殖作用和IC50值見圖4。順鉑脂質體體外抗腫瘤活性顯著大于納米粒。

表2 順鉑細胞消除動力學參數Table 2 Cellular efflux parameters for CDDP and CDDP-nanocarriers

3 討論

為保證載體可比性，我們通過調節工藝制備了粒徑、電位、載藥量、體外釋放相近的兩種順鉑載體。脂質體和納米粒72 h累積釋放約30%，可保證后續的細胞實驗過程中藥物不從或僅少量從系統中釋放，避免游離藥物攝取而干擾實驗結果。

圖4 順鉑脂質體和納米粒體外抗腫瘤活性(A)和IC50值(B，與順鉑溶液比較，*:P＜0.05)Fig.4 Cytotoxicity of CDDP-nanocarriers and CDDP solution towards A549 cells(A)and their IC50s(B，*:P ＜0.05 vs CDDP)

從Pt攝取結果分析，兩種納米載體均能不同程度地被細胞攝取。胞內藥物含量以順鉑溶液為最高，兩種載體中，明膠納米粒的攝取水平較高。這主要和藥物內化效率有關。順鉑分子是通過被動擴散和銅離子轉運蛋白家族主動轉運入胞的［10］，而兩種納米載體的細胞攝取均受CPZ和低溫抑制，表明脂質體和納米粒是通過相對低效的顆粒內吞途徑入胞的。結合非律平和CytD的抑制結果，說明clathrin介導的內吞和大胞飲參與了脂質體的內吞，通過兩種途徑入胞的藥物各占一半。明膠納米粒主要依賴clathrin途徑入胞，少量粒子通過大胞飲內吞。由于納米載體構成的差異，使其內吞途徑呈現出多樣性［11］，繼而影響內化水平和胞內傳遞過程。納米給藥系統的細胞膜吸附在攝取實驗中普遍存在，吸附力強的粒子可在細胞表面或病變部位有更長的滯留時間，有利于持續釋放藥物。本實驗使用了胰酶消化法來處理吸附載體［12］，兩種納米載體均增加了藥物的細胞膜吸附，其中，明膠納米粒的吸附力比脂質體更強，這與載體材料和細胞膜之間的親和力有關。

順鉑入胞后主要與DNA和胞漿蛋白結合，游離分子通過銅外排轉運體ATP7A/ATP7B［13］被排出細胞。通過對消除比例的分析我們發現，納米粒組的藥物消除率遠高于脂質體和溶液組，后者的胞內滯留能力更好。以一室模型擬合計算藥動學參數(表2)，結果顯示脂質體的消除速率常數小于納米粒，MRT與溶液劑相當。順鉑溶液的AUC最大，納米粒最小。這可能和載體的胞內傳遞過程有關。納米顆粒被內吞后，會經過內體、溶酶體等細胞內膜系統而被消化和降解，從而導致載體結構的破壞和藥物的釋放［14］。另一部分未被降解的載體顆粒則可經回收內體被視作異物排出細胞［15］。從載體消除實驗結果分析，脂質體可能在胞內某些內膜結構中被破壞，將物理包裹的順鉑釋放出來，游離的藥物分子繼而與靶點結合，因此消除比例和溶液組類似。而明膠納米粒經過交聯后在胞內的降解時間較長，小分子明膠降解片段與藥物仍然以共價鍵的方式結合，需要通過離子交換實現順鉑的釋放［16］。因此，GPs-Pt的緩慢釋放使順鉑分子難以及時地與胞內靶點結合，而未完全降解的粒子則可能通過回收過程被清除出細胞。

從細胞攝取結果分析，順鉑明膠納米粒的內化水平比順鉑脂質體高。而消除動力學結果顯示，順鉑脂質體較順鉑明膠納米粒更利于實現胞內釋放和胞內滯留。在兩種因素的相互作用下，我們用抗細胞增殖實驗評價兩種納米給藥系統的體外抗腫瘤活性。脂質體和明膠納米粒的IC50值均大于順鉑溶液，這與動力學AUC結果相符。盡管納米粒的胞內攝取含量高于脂質體，但后者的抗腫瘤活性顯著優于前者。這與納米粒胞內釋放少、消除多有關。

納米載體的包裹改變了順鉑入胞途徑和內化水平，對后續的細胞轉運和藥物外排均有影響。在敏感細胞中未發現脂質體或納米粒增強順鉑抗腫瘤活性的趨勢，但顆粒包裹順鉑具備降低藥物毒性［17］、胞外緩釋［18］、克服多藥耐藥等優勢［19］。在A549細胞中，順鉑脂質體較明膠納米粒有更長的胞內滯留時間和更大的AUC，抗腫瘤活性遠高于納米粒。順鉑脂質體是更適合順鉑發揮療效的納米載體。

［1］YAN F，ZHANG C，ZHENG Y，et al.The effect of poloxamer 188 on nanoparticle morphology，size，cancer cell uptake，and cytotoxicity ［J］.Nanomedicine，2010，6(1):170-178.

［2］PEETLA C，LABHASETWAR V.Biophysical characterization of nanoparticle-endothelial model cell membrane interactions ［J］.Mol Pharm，2008，5(3):418-429.

［3］VON GERSDORFF K， SANDERS N N，VANDENBROUCKE R，et al.The internalization route resulting in successfulgene expression depends on polyethylenimine both cell line and polyplex type ［J］.Mol Ther，2006，14(5):745-753.

［4］HO Y P，AU-YEUNG S C，TO K K.Platinum-based anticancer agents:Innovative design strategies and biological perspectives［J］.Med Res Rev，2003，23(5):633-655.

［5］WERNYJ R P，MORIN P J.Molecular mechanisms of platinum resistance:stillsearching forthe Achilles＇heel［J］.Drug Resist Updat，2004，7(4-5):227-232.

［6］ARIENTI C，TESEI A，RAVAIOLI A，et al.Activity of lipoplatin in tumor and in normal cells in vitro［J］.Anticancer Drugs，2008，19(10):983-990.

［7］TSENG C L，SU W Y，YEN K C，et al.The use of biotinylated-EGF-modified gelatin nanoparticle carrier to enhance cisplatin accumulation in cancerous lungs via inhalation ［J］.Biomaterials，2009，30(30):3476-3485.

［8］BURGER K N，STAFFHORST R W，DE VIJLDER H C，et al.Nanocapsules:lipid-coated aggregates of cisplatin with high cytotoxicity ［J］.Nat Med，2002，8(1):81-84.

［9］PELEG-SHULMAN T，GIBSON D，COHEN R，et al.Characterization of sterically stabilized cisplatin liposomes by nuclear magnetic resonance ［J］.BiochimBiophysActa，2001，1510(1-2):278-291.

［10］WANG D，LIPPARD S J.Cellular processing of platinum anticancer drugs［J］.Nat Rev Drug Discov，2005，4(4):307-320.

［11］RYMAN-RASMUSSENJP，RIVIERE JE，MONTEIRO-RIVIERE N A.Variables influencing interactions of untargeted quantum dot nanoparticles with skin cells and identification of biochemical modulators ［J］.Nano Lett，2007，7(5):1344-1348.

［12］DI MARZIO L，MARIANECCI C，CINQUE B，et al.pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells:Binding，uptake and endocytotic pathway［J］.Biochim Biophys Acta，2008，1778(12):2749-2756.

［13］SAFAEI R.Role of copper transporters in the uptake and efflux of platinum containing drugs［J］.Cancer Lett，2006，234(1):34-39.

［14］DELLI CASTELLI D，DASTR? W，TERRENO E，et al.In vivo MRI multicontrast kinetic analysis of the uptake and intracellular trafficking of paramagnetically labeled liposomes［J］.J Control Release，2010，144(3):271-279.

［15］JIN H，HELLER D A，SHARMA R，et al.Sizedependent cellular uptake and expulsion of singlewalled carbon nanotubes:single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles［J］.Acs Nano，2009，3(1):149-158.

［16］KONISHI M，TABATA Y，KARIYA M，et al.In vivo anti-tumor effect through the controlled release of cisplatin from biodegradable gelatin hydrogel［J］.J Control Release，2003，92(3):301-313.

［17］LI X，LI R，QIAN X，et al.Superior antitumor efficiency ofcisplatin-loaded nanoparticles by intratumoral delivery with decreased tumor metabolism rate［J］.Eur J Pharm Biopharm，2008，70(3):726-734.

［18］DING D，ZHU Z，LIU Q，et al.Cisplatin-loaded gelatin-poly (acrylic acid) nanoparticles:synthesis，antitumor efficiency in vivo and penetration in tumors ［J］.Eur J Pharm Biopharm，2011，Epub ahead of print.

［19］KRIEGER M L，ECKSTEIN N，SCHNEIDER V，et al.Overcomingcisplatin resistance ofovarian cancer by targeted liposomes in vitro［J］.Int J Pharm，2010，389(1-2):10-17.