紡錘體組裝檢測點基因BubR1的研究進展

陳曌君，李 鋒，楊 軍 綜述

(1.浙江大學公共衛生學院毒理系，浙江 杭州 310058;2.山西省侯馬市人民醫院，山西 侯馬 043000)

上世紀90年代初期，研究人員在酵母基因篩查試驗中找到一系列與紡錘體檢測點調控有關的基因，并證實這些基因在高等動物中高度保守，其編碼的蛋白是紡錘體檢測點(spindle assembly checkpoint，SAC)的重要組成成分［1-2］。SAC成員主要包括Mad1(mitotic arrestdeficient 1)、Mad2，Bub1(budding uninhibited by benzimidazoles 1)、Bub3，BubR1(Bub-related 1)，Msp1(monopolar spindle 1)，Aurora B 等蛋白［3］。其中，BubR1是 SAC中的重要組分，在調控SAC的監測機制中起著重要的作用。近來有研究表明，BubR1不但參與監測有絲分裂過程中微管與著絲點的結合，還在細胞減數分裂過程、DNA損傷應答、腫瘤、不孕和衰老［4-7］等方面起到重要的調控作用。現將紡錘體檢測點蛋白BubR1的功能及研究現狀做一綜述。

1 BubR1在紡錘體檢測點中的作用

紡錘體檢測點又稱有絲分裂檢測點，在監測染色體的正常分離及阻止非整倍體形成的過程中起到重要的作用。在細胞有絲分裂中期，只有當染色體全部正確地與來自紡錘體兩極的微管結合并排列到赤道板上，有絲分裂后期促進因子(anaphase-promoting complex/cyclosome，APC/C)才能與其活化因子Cdc20結合，并通過泛素化其底物(如CyclinB1、Securin)使細胞進入有絲分裂后期［8］。否則，SAC這一檢測通路將會被激活，從而阻止細胞由分裂中期進入后期。

1.1 BubR1在有絲分裂SAC中的作用 在有絲分裂中，BubR1主要是感受姐妹染色單體上著絲點間的張力［9］以及著絲粒相關蛋白 E(centromere associated protein-E，CENP-E)共同監測著絲點上微管的附著狀態［10］。一旦著絲點與微管未連接或著絲點間的張力不平衡將導致SAC監測機制的激活［8］。SAC被激活后，BubR1借助其結構上所具有的不依賴Mad2的Cdc20結合位點與Cdc20蛋白結合并抑制其活性［11-12］。另外，BubR1也可通過Mad2與Cdc20結合，形成Bub3-BubR1-Cdc20復合體從而抑制APC/C 的活性［13-14］;同時研究顯示，BubR1 先于Mad2與Cdc20結合，且對APC/C的抑制能力更強［15］。BubR1還可與Bub3、Mad2 和Cdc20形成有絲分裂檢測點復合物(mitotic checkpoint complex，MCC)四聚體，抑制 APC/C的活性［16-17］，從而阻止細胞進入有絲分裂后期。只有當所有的紡錘體微管與著絲點正確連接，產生適當的張力，SAC監測機制關閉，Cdc20被釋放，細胞才能進入有絲分裂后期［4］。

BubR1基因的缺失將導致SAC的妥協反應［18］。研究表明，BubR1基因缺失的細胞能夠逃逸微管解聚劑——諾考達唑(nocodazole)引起的有絲分裂阻滯而進入分裂后期，造成細胞具有異常的染色體數目，即非整倍體。BubR1在SAC上的作用存在一定的劑量依賴效應。Bohers等［19］人的實驗表明:在有絲分裂過程中，細胞經紡錘體干擾物——秋水仙堿(colchicine)處理后所引起細胞阻滯的比例與細胞中BubR1的表達水平呈正相關;且BubR1減少將引起染色體的超前分離(premature chromatid separation，PCS)，當 BubR1 的水平低于50%時，非整倍體的數量明顯增加。因此，BubR1的作用與其數量有關，且影響著非整倍體的產生。

1.2 BubR1在減數分裂SAC中的作用 在減數分裂與有絲分裂過程中SAC的不同之處僅僅在于減數分裂I期染色體間所產生的張力是來自于同源染色體而非姐妹染色單體。當同源染色體上的著絲點與微管沒有正確的連接或是在同源染色體間產生不適當的張力，就會激活SAC，使細胞停滯于前中期。在減數分裂II期，染色體與微管的連接、SAC的激活等均與有絲分裂相一致［20］。Wei［4］等人研究表明:BubR1基因缺失的卵母細胞經nocodazole處理后，能逃逸SAC依賴的細胞周期停滯;BubR1的過度表達會使細胞停滯在第一次減數分裂中期的時間延長;而BubR1表達不足則會加速細胞減數分裂的過程。這些結果揭示了BubR1是第一次減數分裂中期SAC所必需的，這可能是由于BubR1表達增加/不足引起紡錘體檢測點信號增強/減弱，從而延長/縮短了減數分裂的時間，符合“檢測點信號增強”假說。

2 BubR1參與DNA損傷應答調控

當細胞進入有絲分裂期后遇到DNA損傷，通過啟動“自殺”或者激活SAC來延緩細胞有絲分裂的過程，給細胞足夠時間將錯誤予以修復，從而來維持基因的完整性。在酵母、果蠅或是哺乳動物細胞［21-23］中SAC都能通過停滯有絲分裂的過程來應答DNA損傷，而BubR1作為SAC蛋白，在此過程中起著重要的作用。Hyunsook和Lee等［24-25］報道了經阿霉素(一種抗腫瘤藥物)處理細胞產生雙鏈斷裂(double strand breaks，DSBs)后，大量的 BubR1結合到著絲點上，其磷酸化的時間延長，與對照組相比有絲分裂過程延遲9 h，這可能是由于DSBs改變了染色體的拓撲結構，從而影響了著絲點-微管粘附的狀態，引發了BubR1對此產生的一系列應答反應。另外，在酵母［24］、BRCA2缺失細胞［25］等研究表明 DNA損傷檢驗點(DNA damage checkpoint，DDC)與 SAC在 DNA 損傷修復中起著協同作用，而BubR1可能是介導這兩條通路交叉應答(cross-talk)上的重要因子。Dai［5］等人也證實了這一結論:經阿霉素和紫外線誘導的BubR1+/-MEFs細胞DNA受損后，引起有絲分裂停滯，同時伴隨著γH2AX、p53、p21、PARP-1蛋白表達水平的降低。

3 BubR1的磷酸化

細胞內BubR1蛋白的數量與其功能相關，且共價修飾尤其是磷酸化修飾在其功能的調控上也起著重要的作用。研究表明，BubR1作為Plk1激酶的底物，能被Plk1磷酸化，磷酸化后的BubR1對維持著絲點-微管連接的穩定性起著重要的作用，但不是其與SAC或APC/C連接所必須的［26-28］。Elowe 等［26］人研究表明，削弱BubR1與Plk1之間的關聯，會使BubR1磷酸化缺失，最終導致著絲點-微管穩定性的降低。而且，BubR1的S676位點磷酸化對著絲點張力敏感。當染色體排列在赤道板上即姐妹染色體著絲粒上形成張力時，S676位點上的磷酸化消失;當再次用紫杉醇短暫處理后，pS676又會快速地出現。另外，Wong等［29］在非洲蟾蜍卵提取物的研究中發現，BubR1作為Plk1的底物，磷酸化后產生的3F3/2磷酸化表位在SAC中有一定的作用。然而，Timothy［10］等在BubR1上找到4個有絲分裂特有的磷酸化位點，這些位點不能夠被Plk1和Aurora B激酶磷酸化，且BubR1基因S670位點和S1034位點上的磷酸化對著絲點與微管間連接的缺失高度敏感，而對著絲點上的張力不敏感［10］，與之前Elowe等人證實的pS676位點對著絲點張力敏感的結論剛好相反［26］。這可能是BubR1磷酸化的位置是由微管粘附的狀態和著絲點上的張力所決定的。另外，還有研究報道［15］BubR1的磷酸化和乙酰化是BubR1由APC/C復合物的抑制劑轉變為APC/C底物的過程。

4 BubR1在腫瘤形成、不孕、衰老中的作用

由于BubR1對染色體的分離有特殊檢測功能，近來越來越多有關腫瘤方面的研究聚焦在BubR1這個重要的因子上。許多研究［30-31］表明，BubR1基因的缺失或半缺失(haploinsufficiency)導致染色體不穩定，最終觸發腫瘤的形成，如肺癌、結直腸癌。Kakeji等［6］報道50.3%的胃癌患者BubR1蛋白表達水平明顯增加，而且BubR1蛋白表達水平與DNA非整倍體間存在顯著的關聯性;BubR1高表達的患者常伴有腫瘤的深度浸潤，以及生存率的降低。這可能是由于BubR1的過度表達導致MCC的減少，從而致使SAC監測能力下降，讓染色體不穩定的細胞逃避監測后直接進入有絲分裂后期，最終造成DNA非整倍體的產生。

在腫瘤治療中，常利用抗癌藥物誘導基因損傷，激活細胞周期檢測點信號傳導通路，使細胞分裂停滯或者誘導其凋亡。然而，有許多因素可造成腫瘤對化學藥物的治療效果不佳，其中檢測點成分(如BubR1)表達異常所致的檢測點功能失常就是重要的原因之一［32］。因此，BubR1在腫瘤治療中倍受關注。

此外，BubR1蛋白表達水平與機體的不孕、衰老等有著密切的關系［7］。研究表明［33］:BubR1－/－大鼠的胚胎不能正常發育;BubR1－/H大鼠(表達BubR1蛋白水平的量是野生型的4%)的胚胎雖然能夠發育至出生，但出生后只能存活數小時。Baker等［34］人觀察到BubR1H/H的大鼠出生時生長狀態良好，但出生2～3個月就會表現出一些異常癥狀，如:雙側白內障、真皮和皮下脂肪減少、惡病質、損傷修復能力下降、生命周期減短等衰老的癥狀。4個月大的BubR1H/H大鼠的精子量是野生型大鼠的1/4;體外受精實驗(BubR1H/H大鼠的精子和野生型大鼠的卵子結合)表明受精后的卵子發育為正常胚胎的數量明顯減少，僅為正常大鼠受孕后胚胎數的1/13。

5 展望

目前，雖然BubR1的功能及其作用機制已較為明確，但大部分僅限于體外實驗或動物實驗，特別是在腫瘤的形成和治療上，仍有許多細節亟待解決。因此，對BubR1基因結構、功能以及它與其他相關因子間相互作用等的深入研究，勢必有益于進一步闡明BubR1與腫瘤、不孕、衰老等相關疾病的聯系，從而為解決這些困擾人類已久的問題提供新的思路。

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