NMDA受體依賴的神經元存活及保護作用的機制

杜 嵩，羅建紅，邱 爽 綜 述

NMDA受體依賴的神經元存活及保護作用的機制

杜 嵩，羅建紅，邱 爽 綜 述

(浙江大學醫學院神經生物系、衛生部醫學神經生物學重點實驗室，浙江杭州310058)

NMDA受體屬于谷氨酸受體，它在突觸傳遞和突觸可塑性中都發揮著非常重要的作用，其介導的興奮性毒性是腦缺血、缺氧和腦外傷等導致腦損傷的重要分子機制。但是，近年來的研究發現，在生理和某些病理情況下，NMDA受體的激活具有促進神經元存活及保護神經元免受損傷的作用。

腦損傷/藥物療法;神經元/藥物作用;突觸傳遞;NMDA受體;存活;機制

［JZhejiang Univ(Medical Sci)，2011，40(4):440-445.］

NMDA受體屬于谷氨酸受體，是中樞神經系統中非常重要的興奮性神經遞質受體。NMDA受體有三個編碼基因，分別編碼NR1、NR2、NR3 亞單位［1］。NR1 亞單位有一個甘氨酸結合位點，對于形成功能性受體是必需的，沒有該亞單位的表達，新生小鼠會由于呼吸衰竭而在出生后幾小時內死亡。NR1亞單位有8種剪切變體，可由NR1編碼基因的3個外顯子重排組合而成，幾乎全腦表達。NR2亞單位包括4個亞型(NR2A-D)。該亞單位有一個谷氨酸結合位點，具有調節受體活動的功能。該亞單位的表達具有區域性和時間特異性，NR2B和NR2D在胚胎時期全腦組織廣泛表達，而NR2A和NR2C分別在成年后的腦干和小腦組織表達，在NMDA受體復合物中，NR2決定了通道的導電性和動力學特性以及對藥物的敏感性［2］。NR3由NR3A和 NR3B兩個亞型組成，還待進一步研究其生理學意義和藥理學功能。NMDA受體對鈣離子有很高的通透性。當它被激活時，可以產生鈣內流，從而激活一系列的下游信號因子，參與神經細胞之間的信號傳遞。但是在某些病理情況下，如缺血缺氧、腦外傷等，谷氨酸大量釋放，大量的Ca2+進入神經元導致鈣超載，最終使神經元變性壞死，出現病理情況下的神經系統功能缺失或減退［3］。因此，NMDA受體一直是人們試圖有效治療腦中風、腦外傷等疾病的關鍵靶點。可讓人困惑的是，NMDA受體的拮抗劑并沒有起到很好的臨床療效，雖然這其中有很多種因素，例如治療的時機，藥物的選擇性等等，但是，有一點是不容忽視的，那就是越來越多的研究提示，生理水平NMDA受體活性是有神經保護作用的［4］，并且在某些病理條件下，NMDA受體的激活也具有保護神經元免受損傷的作用。這為重新認識NMDA受體的多面性提供了新的視角，正如Feng認為的那樣，川劇中的變臉是自然界中最藝術的生命法則［5］。文中，先簡要總結NMDA受體介導的興奮性毒性的分子機制，然后重點概括近20年來，人們對NMDA受體依賴的神經元存活及神經元保護作用機制的研究進展。

1 NMDA受體介導的興奮性毒性及分子機制

NMDA受體屬于離子型谷氨酸受體，當它被激活時，除了對Na+、K+具有通透性之外，NMDA受體主要負責Ca2+的內流。Ca2+是神經元信號傳遞的第二信使，它介導了NMDA受體的很多生理功能。但是，在病理狀態下，比如腦損傷，低氧或者缺血損傷等，神經元處于周圍谷氨酸水平較高的環境中，導致NMDA受體被大量激活，使得過多Ca2+內流，產生鈣超載，引起神經元的凋亡或者死亡［6］。

目前，關于NMDA受體介導的興奮毒性的信號通路已經研究的比較透徹。例如，它可以通過激活GSK3β引起細胞凋亡。GSK3β可以激活PP1并抑制CREB產生興奮毒性。有研究發現，GSK3β的Ser9位點的磷酸化可以抑制其活性［7］。在神經元存活通路中涉及到的 Akt、PKA、PKC和EKR1/2，可以通過磷酸化GSK3β的Ser9位點來抑制其活性，GSK3β的激活可以導致細胞凋亡，抑制其活性可減輕凋亡的發生。NMDA受體過度激活，還可以通過nNOS通路引起神經元的凋亡或死亡。nNOS系統被激活后可以產生氧化應激，激活下游的 JNK和PARP分子，導致線粒體的功能紊亂和去極化作用增強。這些都是線粒體釋放凋亡因子的因素，然后發生一系列的凋亡后續反應，導致神經元死亡。Calpain通路的激活則是NMDA受體產生興奮性毒性的另一條通路。NMDA受體的過渡激活使Calpain激活，導致mGluR1α的分解，抑制Akt活性，使得線粒體加速釋放凋亡因子進而促進凋亡。

2 參與NMDA受體促進神經存活及神經保護作用的信號通路

NMDA受體的神經保護作用最初是在1994年被研究發現的。Gould小組發現，出生1周之內的大鼠，如果在體阻斷NMDA受體的活性，可以導致健康的海馬神經元數目的下降［8］。隨后，陸續有文章報道，發育早期，阻斷NMDA受體的活性可以導致很廣泛的凋亡，并增強缺血缺氧所造成的腦損傷［9-11］。更有意思的是，在成年的中樞神經系統，如果在缺血性腦損傷之后給予阻斷NMDA受體，那么可以加速神經元的丟失［12］，并抑制海馬齒狀回新生神經元的存活［13］。

為了能夠更有效地研究NMDA受體介導神經保護作用的信號通路，人們開始嘗試建立細胞模型。最初，這些細胞模型主要是建立在用不同濃度的谷氨酸來處理小腦顆粒細胞基礎之上的［14］。但是，這大多都是一種非生理的情況，并且細胞外孵育谷氨酸可以同時激活突觸內和突觸外的NMDA受體，并不是非常理想的細胞模型。隨后，英國的Bading小組和之后的Hardingham小組建立了一種全新的體外NMDA受體神經保護的細胞模型［15-16］。他們發現，如果對神經元，包括海馬神經元和皮層神經元，進行饑餓處理，會導致神經元的凋亡。但是，如果同時給予GABA受體的拮抗劑來提高神經元的突觸前遞質釋放，激活突觸后受體，可以逆轉饑餓所導致的神經元死亡，并且這個過程是NMDA受體依賴的。這一模型的建立極大地推動了NMDA受體神經保護作用分子機制的研究。下面總結NMDA受體參與神經保護功能的幾條信號通路。

2.1 PI3K/Akt信號通路 PI3/Akt也稱蛋白激酶B(PKB)，是級聯反應信號途徑中的重要分子。在培養的小腦顆粒細胞，皮層神經元和大鼠海馬神經元的細胞模型中發現，當NMDA受體激活后，Ca2+入胞，以 Ca2+/camodulin的方式激活PI3K。該酶細胞膜上的PtdIns(4-5)P2催化為PtdIns(3-5)，并征募PDK1以及它的底物 Akt到細胞膜上，通過 PH(pleckstrin homology)結構域與PtdIns(3-5)P3相互作用。PDK1和PDK2一起磷酸化并激活Akt，而后，Akt通過磷酸化失活GSK3β(glycogen synthase kinase 3β)來提高神經元存活和生長。該通路對于NMDA受體的信號轉導來說具有神經保護作用［17］。NMDA受體在生理水平被激活時可以產生激活Akt通路的生物學效應，但是過度激活NMDA受體不但不能激活Akt通路的神經保護作用，還會抑制Akt通路的作用導致神經興奮毒性的加重。Akt不但參與NMDA受體激活的神經保護作用，它還參與了抗凋亡作用，如使BAD(Bcl2/Bcl-XL-antagonist引起細胞死亡)磷酸化后失活，中止與其家族成員Bcl-2和Bcl-XL的相互作用;另外，JNK(c-Jun N-terminal kinase)/p38激活劑ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1)也可以被Akt的磷酸化所抑制［9，17］。

2.2 ERK信號通路 細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)是真核細胞內絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的家族成員，在神經元保護作用通路上起到重要的作用。研究發現，培養的大鼠皮層神經元或小腦顆粒細胞，缺血缺氧預處理后，NMDA受體可以通過介導ERK1/2通路產生抗神經元凋亡的作用，如果阻斷 ERK1/2，則可以完全消除NMDA受體對神經元的保護作用。另外，在氧糖剝奪的大鼠皮層神經元細胞模型中也發現，缺血缺氧導致 NMDA受體激活，后者增加BDNF的釋放，BDNF進一步激活 ERK1/2，發揮神經保護作用。如果在此模型下注入NMDA受體拮抗劑，可以使ERK1/2的活性降低，破壞NMDA受體的神經保護作用。

2.3 Ca2+/Calmodulin依賴的激酶前存活信號途徑 雖然細胞外鈣離子的過多內流是造成神經元損傷的關鍵因素，但是，Ca2+/Calmodulin依賴的激酶如 CaMKK和 CaMKs，卻參與了NMDA受體介導的神經保護作用。研究發現，CaMKII和 CaMKIV 兩個激酶的抑制劑［18］，例如KN62，可以阻斷該通路的保護作用。Calmodulin抑制劑W13也有類似的功能。在NG108神經膠質細胞中，撤除血清誘導的神經元凋亡，可以由NMDA介導產生保護作用;但是，由于CaMK的激酶(CaMKK)顯性激活突變體形式，可以抑制NMDA產生的保護作用［19］。CaMKK神經元保護作用的機制在于，它可以直接磷酸化和激活蛋白激酶Akt。我們在上文中，已經提及Akt的神經保護作用機制［20］。

2.4 CREB通路和 NF-kB通路 轉錄因子CREB是一個重要的活性依賴的基因表達介導因子，CREB轉錄因子的Ser133位點磷酸化可以征募CBP，當與CRE結合后，可以誘導CRE依賴的基因表達。Hardingham和他的同事發現［21］，在大鼠皮層神經元中，突觸NMDA受體的激活誘導CREB(cAMP-response element binding protein)的Ser133位點磷酸化，激活CRE依賴的轉錄。其中［22］，兩個基因參與了突觸NMDA受體依賴的神經保護。一個是BTG2，潛在的抗凋亡 CREB作用靶基因;另一個是BCL6，p53基因的轉錄抑制因子，同為潛在的CREB作用靶基因。

NF-kB是Rel家族的一員，屬于轉錄因子。NMDA受體的激活增加NF-kB的親和性，也提高了I-kB的磷酸化，參與NMDA受體的神經保護作用［23］。還有一類受CRE調控的神經營養因子 BDNF(brain-derived neurotrophic factor)，NMDA受體激活后上調其表達，提高神經元的存活狀態。經過長時間的研究，人們發現NMDA受體和細胞外信號調節激酶1/2-cAMP應答元件結合蛋白(ERK1/2-CREB)信號通路失耦聯導致BDNF表達下降［24］，可能是導致神經元大量凋亡的原因。另外還有一些轉錄因子，如 Elk、SRF、NFAT、AP1 等是否參與 NMDA受體介導的神經保作用，還沒有詳細的機制闡釋，有待進一步研究［25］。

3 NMDA受體神經保護作用的亞單位依賴性

NMDA受體既具有神經保護作用，又參與興奮毒性，目前并不是非常清楚NMDA受體這種雙重作用的分子機制。最初大家認為，是NMDA受體介導的Ca2+內流程度導致了功能的差異，中度的NMDA受體活性對神經元是有益的，而如果大量激活NMDA受體，導致鈣超載，則導致細胞死亡。后來研究發現，NMDA受體NR2亞單位起到調節通道電生理和藥理特性，以及介導不同細胞內信號通路的作用。例如，含NR2A的NMDA受體亞型與含NR2B的NMDA受體亞型，在突觸可塑性中可能起到截然不同的作用［26-27］。那么，NMDA受體的神經保護作用或者神經損傷作用是否也同樣有這種亞單位的差異呢?對于這一問題，目前還沒有明確的定論。不過很多研究都傾向于含NR2B的受體亞型參與了NMDA受體介導的興奮毒性作用，而含 NR2A的受體亞型則參與了NMDA受體介導的神經元保護作用［28］。但是也有些研究提示，不同部位的NMDA受體介導不同的作用。例如Hardingham小組的研究提示，突觸部位NMDA受體的激活可以通過促進PI3/Akt，ERK/CREB等通路激活，產生神經保護作用，而突觸外NMDA受體的激活則更傾向于介導神經損傷作用。在Hardingham的研究中同樣發現，NMDA受體的這種神經保護作用是可以被ifenprodil所阻斷。這提示此作用是含NR2B的NMDA受體亞型所依賴的。本實驗室的研究也提示，神經元饑餓模型的NMDA受體保護作用可以被ifenprodil阻斷，但是不能被PPPA(含NR2A的NMDA受體亞型拮抗劑)阻斷(數據未發表)。當然，NMDA受體的功能還有可能受到不同的發育階段，不同的腦區，甚至不同的疾病模型的影響。最近研究發現，在NMDA受體龐大的信號網絡中，存在一些關鍵因子，影響或決定了NMDA受體功能的導向。例如 DAPK1(death-associated protein kinase)，腦缺血可以將DAPK1征募到突觸外的NMDA受體，導致NR2B亞單位S1303位點發生磷酸化，改變通道功能，并最終引起細胞凋亡/死亡［29］。因此，我們還不能肯定地說究竟是哪種受體亞型，或者哪種細胞定位的受體決定了NMDA受體介導神經保護或者神經損傷功能。

4 對NMDA受體研究的展望

目前的研究提示，對于神經元來說，其生物學反應對NMDA或者谷氨酸的感受過程可以用鐘型曲線來描述:當刺激逐漸增加時神經元的興奮性反應增加，到達最高峰后，刺激的增加導致神經元反應的下降，即經典的鐘型反應曲線學說［17］(classic bell-shaped curve model)，適度的NMDA受體激活能夠提供神經元存活的幾率，過弱或過強的對NMDA受體的刺激都會引起神經元的死亡［29］。Ca2+又是死亡信號痛路中最為重要的第二信使，鈣離子濃度的閾值是一個分界點。該閾值(threshold)濃度是激活神經元存活通路信號的全程扳機點(trigger point)，通過下游信號通路上的PI3K、ERK1/2、CaMKIV的激活產生神經元存活效應，一旦Ca2+超過該閾值就會發生毒性水平的一些列生化事件，激活具有神經毒性的信號通路，通過激活Calpain、線粒體Ca2+重吸收或者NO的產生，造成使神經元死亡的嚴重后果［30］。適當地激活NMDA受體有利于神經元的存活和神經元保護作用，過度地激活NMDA受體后，只會產生相反的生物學效應，致死神經元。因此，在將來針對神經保護作用的藥物研發中，NMDA受體的這一特點都需要更加引起人們的重視。

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Mechanism of NMDA receptor-dependent neuronal survival and neuroprotection

DU Song，LUOJian-hong，QIU Shuang
(Institute of Neuroscience，College of Medicine，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China)

NMDA(N-methyl-D-aspartate)receptors are a subtype of glutamate receptor，and play an important role in both synaptic transmission and synaptic plasticity.When excessively excited，NMDA receptors can cause cell death in many neuropathological scenarios such as OGD(oxygen and glucose deprivation)and brain injury.However，recent studies have revealed that under the physical and some pathological conditions，NMDA receptor could promote neuronal survival and protect neurons from damage.

Brain injuries/drug ther;Neurons/drug eff;Synaptic transmission;NMDA receptor;Survival;Mechanism

R 651.15

A

1008-9292(2011)04-0440-06

http:∥www.journals.zju.edu.cn/med

10.3785/j.issn.1008-9292.2011.04.017

2010-11-15

2011-01-25

國家“蛋白質重大科學研究計劃”項目(2010CB912002);國家自然科學基金重點項目(30730038);浙江省自然科學基金(Y2100425).

杜 嵩(1982-)，男，碩士研究生，神經生物學專業.

邱 爽(1976-)，女，博士，副教授，從事神經生物學研究;E-mail:qiushly@zju.edu.cn

［責任編輯 張榮連］