赤芍總苷對人黑色素瘤細胞株凋亡誘導(dǎo)的作用機制

王亞珍 呂品田 王鳳紅 王辰英 (河北省人民醫(yī)院保健處，河北 石家莊 05005)

赤芍為毛茛科植物芍藥或川芍藥的干燥根，其主要活性成分已證實為赤芍總苷(TPG)。其化學(xué)本質(zhì)為單萜苷類化合物，具有抗血栓、抗凝作用，抗動脈粥樣硬化、抗心肌或腦組織損傷作用等廣泛藥理作用〔1，2〕。近年研究證實TPG也具有抗腫瘤的作用〔3〕，但相關(guān)機制仍不清楚。黑色素瘤惡性程度高，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移迅速，迄今尚無有效治療措施。本研究通過觀察TPG對人黑色素瘤細胞株A375生長的影響及凋亡調(diào)節(jié)基因表達的檢測，探討TPG抗腫瘤的機制，為TPG防治黑色素瘤提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株及藥物 人黑色素瘤細胞株A375:購自中國科學(xué)院上海細胞研究所。赤芍總苷由河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院惠贈，純度＞95%。

1.1.2 主要試劑 MTT，購自 Sigma公司;Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL及GAPDH一抗購自Santa Cruz公司;RT-PCR試劑盒購自大連寶生物技術(shù)公司;所用引物由上海生工生物技術(shù)公司合成，引物序列如下:Caspase-3上游引物5'-GGACAACAACGAAACCTCCG-3'，下游引物:5'-CTCCACTGGTATCTTCTGGCA-3'，擴增產(chǎn)物長度 568 bp;Bcl-2上游引物 5'-AGAGGGGCTACGAGTGGGAT-3'，下游引物5'-TCAAA GAAGGC CACAATCCTC-3'，擴增產(chǎn)物長度373 bp;Bax上游引物5'-GAGGATGATTGCTGACGTGGA-3'，下游引物 5'-TCTTCCAGATGGTGAGCGAG-3'，擴增產(chǎn)物長度337 bp;Fas上游引物5'-TGGAGTTGAAGAGGAGCGT-3'，下游引物 5'-CATTTGGTGTTGCTGGTTCG-3'，擴增產(chǎn)物長度393 bp;FasL上游引物5'-ACCTCCATCACCACTACCA-3'，下游引物 5'-CAACTTCTTCTCCTCCATTAGC-3'，擴增產(chǎn)物長度531 bp;內(nèi)參照β-actin上游引物5'-CAGGGTGTGATGGTGGG-3'，下游引物 5'-GGAAGAGGATGCGGCAG-3'，擴增產(chǎn)物長度500 bp。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測定細胞抑制率 黑色素瘤A375細胞以含10%胎牛血清的RPMI 1640常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞制成細胞懸液，接種于 96 孔板，每孔 200 μl，加入 12.5、25、50、100、200 mg/L TPG，對照組加等量生理鹽水，每組6個復(fù)孔。分別孵育24、48 h后進行MTT法，酶標(biāo)儀測量各組細胞吸光度OD490值，計算生長抑制率(%)=(1－實驗組OD值/對照組OD值)×100%。以上實驗重復(fù)3次。

1.2.2 FCM測定細胞凋亡百分率 黑色素瘤細胞加入25 mg/L TPG作用48 h，對照組加等量生理鹽水，收集細胞，Becton Dickinsor FACscan流式細胞儀檢測細胞凋亡百分率。

1.2.3 RT-PCR 方法測定 Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL mRNA的表達 黑色素瘤細胞細胞加入25 mg/L TPG孵育48 h，收集細胞，常規(guī)方法提取RNA，按RT-PCR試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴增目的片段，PCR反應(yīng)條件為95℃4 min，預(yù)變性后，95℃ 30 s，56℃ 40 s，72℃ 30 s，25 個循環(huán)后，72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，掃描成像，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行密度分析。以β-actin作為內(nèi)參照。以目的基因/內(nèi)參照密度值的比值進行比較。

1.2.4 Western 印跡法檢測 Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL 蛋白的表達 25 mg/L TPG孵育黑色素瘤細胞48 h，收集細胞，常規(guī)方法提取蛋白質(zhì)，定量，SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，相應(yīng)一抗4℃孵育過夜，PBS漂洗三次后加相應(yīng)二抗 HRP(辣根過氧化酶)-IgG(1∶1 000)，室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，對條帶進行吸光度積分掃描。GAPDH作為內(nèi)參照。用各蛋白吸光度值/內(nèi)參照吸光度值的比值進行比較。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)。計量資料采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 TPG對黑色素瘤A375細胞抑制率的影響 TPG對A375細胞有抑制作用，隨著TPG濃度增大和作用時間的延長，抑制率上升。見表1。

表1 TPG對黑色素瘤A375細胞抑制率的影響(n=6， ± s，%)

表1 TPG對黑色素瘤A375細胞抑制率的影響(n=6， ± s，%)

劑量(mg/L) 24 h抑制率 48 h抑制率12.5 4.61±0.69 8.52±0.79 25 14.33±2.61 19.53±2.66 50 39.27±3.23 31.09±4.05 100 59.11±3.26 70.96±4.96 200 66.82±5.95 83.67±6.74

2.2 TPG對黑色素瘤細胞凋亡率的影響 與對照組比，25 mg/L TPG處理黑色素瘤細胞48 h后，細胞凋亡率明顯上升(P＜0.01)。見表2。

2.3 TPG 對黑色素瘤細胞 Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL mRNA表達的影響 與對照組比，TPG處理組Caspase-3、Bax、Fas、FasL mRNA表達水平均顯著升高(P＜0.01)，Bcl-2 mRNA表達水平顯著下降(P＜0.01)，Bcl-2/Bax比值明顯降低(P＜0.01)。見表2，圖1。

2.4 TPG 對黑色素瘤細胞 Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL 蛋白表達的影響 與對照組比，TPG處理組 Caspase-3、Bax、Fas、FasL蛋白表達均顯著升高(P＜0.01)，Bcl-2蛋白表達顯著下降(P＜0.01)，Bcl-2/Bax比值顯著降低(P＜0.01)，與mRNA表達變化一致。見表3，圖2。

表2 TPG對黑色素瘤細胞的細胞凋亡率及Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL mRNA表達的影響(± s，n=6)

表2 TPG對黑色素瘤細胞的細胞凋亡率及Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL mRNA表達的影響(± s，n=6)

與對照組比較:1)P＜0.01，下表同

指標(biāo) 細胞凋亡率(%) Caspase-3 mRNA Bax mRNA Bcl-2 mRNA Bcl-2/Bax F as mRNA FasL mRNA對照組 3.92±0.58 0.46±0.06 0.61±0.08 1.51±0.19 2.46±0.28 0.67±0.08 0.55±0.07赤芍總苷組 10.48±2.051) 0.90±0.111) 1.32±0.151) 0.53±0.071) 0.40±0.051) 1.34±0.161) 1.33±0.211)

表3 TPG對黑色素瘤細胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL蛋白表達的影響( ± s，n=6)

表3 TPG對黑色素瘤細胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL蛋白表達的影響( ± s，n=6)

指標(biāo)Caspase-3 Bax Bcl-2 Bcl-2/Bax Fas FasL對照組 0.41±0.05 0.33±0.04 0.94±0.12 2.81±0.19 0.35±0.05 0.39±0.05赤芍總苷組 0.73±0.081) 0.98±0.111) 0.29±0.041) 0.30±0.051) 0.97±0.141) 0.86±0.091)

圖1 TPG 對 A375細胞 Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL mRNA表達的影響

圖2 TPG對A375細胞Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL 蛋白表達的影響

3 討論

黑色素瘤惡性程度高、轉(zhuǎn)移迅速，迄今尚無有效的治療手段。手術(shù)很難達到對黑色素瘤的根治目的，而該病對于放化療也均不敏感。因此，尋找新的藥物對黑色素瘤進行治療意義重大。近年來赤芍總苷已在多種疾病治療的研究中取得了良好效果〔1～3〕，其機制主要在于該藥可誘導(dǎo)多種腫瘤細胞凋亡而發(fā)揮作用。但該藥是否能對黑色素瘤細胞的凋亡情況發(fā)生影響尚未見報道。本研究顯示，TPG對A375細胞有明顯抑制作用，且隨著TPG濃度增大和作用時間的延長，藥物對腫瘤細胞的抑制率隨之上升，當(dāng)濃度達到200 mg/L時抑制率可達到80%以上。進一步研究發(fā)現(xiàn)25 mg/L TPG作用黑色素瘤細胞48 h，TPG處理組Caspase-3 mRNA和蛋白表達水平均顯著升高，而Caspase-3是凋亡的關(guān)鍵因子之一，可直接參與凋亡的早期啟動、凋亡信號的傳遞及凋亡晚期事件的發(fā)生〔4，5〕，表明TPG可通過增加Caspase-3的表達，誘導(dǎo)細胞凋亡。

細胞凋亡過程受一系列相關(guān)基因調(diào)控，除Caspase-3外，Bcl-2家族通過線粒體途徑影響細胞凋亡，也是目前關(guān)注的熱點。根據(jù)其功能，Bcl-2家族可分為促生存和促凋亡兩類。Bcl-2是迄今為止功能最明確的細胞凋亡拮抗基因〔6〕。原癌基因Bax同屬Bcl-2基因家族，當(dāng)Bcl-2過量時，形成Bcl-2/Bax同源二聚體，細胞凋亡受到抑制;反之當(dāng)Bax過量時，細胞則趨向凋亡，本研究可見，TPG組Bax表達水平升高、Bcl-2水平下降，Bcl-2/Bax比值顯著降低，提示TPG可通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比值誘導(dǎo)黑色素瘤細胞凋亡。

Fas/FasL系統(tǒng)則是介導(dǎo)細胞凋亡的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，F(xiàn)as基因編碼Ⅰ型膜受體蛋白，F(xiàn)asL是Ⅱ型膜蛋白，同屬腫瘤壞死因子受體家族，當(dāng)一個細胞的FasL與另一個細胞的Fas結(jié)合時，可以導(dǎo)致表達Fas的細胞凋亡。正常情況下Fas和FasL并不介導(dǎo)細胞凋亡，只有在Fas/FasL系統(tǒng)過度表達時才介導(dǎo)細胞凋亡，造成組織和器官的損傷〔7〕。本研究觀察到TPG作用黑色素瘤細胞后，F(xiàn)as、FasL蛋白表達水平均顯著升高。我們的結(jié)果提示TPG可通過上調(diào)Fas/FasL表達促進細胞凋亡。

綜上所述，TPG可通過上調(diào)黑色素瘤細胞Caspase-3、Fas和FasL表達，降低Bcl-2/Bax比值，誘導(dǎo)細胞凋亡，發(fā)揮抗癌作用。但本研究僅在細胞水平對該藥促進黑色素瘤細胞凋亡的機制進行了研究，今后還要進一步進行實驗動物研究及臨床應(yīng)用，對該藥治療黑色素瘤的效果進行深入探討。

1 高雪巖，孫建寧，王文全，等.赤芍總苷的制備及其對小鼠肝損傷的保護作用〔J〕.中國實驗方劑學(xué)雜志，2010;16(18):183-6.

2 葛文龍，竇志華，羅 琳，等.赤芍總苷對α-萘異硫氰酸酯誘導(dǎo)的小鼠膽汁淤積型肝損傷的保護作用〔J〕.時珍國醫(yī)國藥，2010;21(11):2881-2.

3 許惠玉，陳志偉，周 麗，等.赤芍總苷非受體依賴途徑誘導(dǎo)K562腫瘤細胞凋亡及相關(guān)基因變化的實驗研究〔J〕.中國中藥雜志，2010;35(24):3377-81.

4 Ristorcelli E，Lombardo D.Targeting Notch signaling in pancreatic cancer〔J〕.Expert Opin Ther Targets，2010;14(5):541-52.

5 D'Amelio M，Cavallucci V，Cecconi F.Neuronal caspase-3 signaling:not only cell death〔J〕.Cell Death Differ，2010;17(7):1104-4.

6 Rohrbach S，Muller-Werdan U，Werdan K，et al.Apoptosis-modulating interaction of the neuregulin/erbB pathway with anthracyclines in regulating Bcl-xS and Bcl-xL in cardiomyocytes〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2005;38:485-93.

7 Baldini E，Ulisse S，Marchioni E，et al.Expression of Fas and Fas ligand in human testicular germ cell tumours〔J〕.Int J Androl，2009;32(2):123-30.