檳榔堿對STZ致INS-1細(xì)胞損傷的保護(hù)和修復(fù)作用

李中平 任文輝 張保麗 藺美玲 陳紅梅 趙 麗 王志強(qiáng) 張小郁

(蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與心理學(xué)研究所，甘肅 蘭州 730000)

目前，許多人工合成的降血糖藥物都很昂貴且長期服用有許多副作用，而從天然植物中提取出來的抗糖尿病藥物具有低毒性、低副作用等優(yōu)點(diǎn)。檳榔堿是檳榔種子中所含生物堿的主要成分，有研究表明檳榔有抗炎、抗過敏作用，低劑量檳榔堿能夠改善2型糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂〔1～3〕。但是檳榔堿對INS-1胰島細(xì)胞的有關(guān)研究尚少。因此，本文體外建立鏈脲佐菌素(STZ)致胰島細(xì)胞損傷模型，研究檳榔堿對STZ損傷胰島細(xì)胞的保護(hù)和修復(fù)作用及其機(jī)制，為檳榔堿治療糖尿病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠胰島素瘤細(xì)胞(INS-1細(xì)胞)，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 試劑 檳榔堿(Arecoline)，純度＞98%，為陜西旭煌植物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。RPMI 1640、胰蛋白酶均購自Gibco公司。STZ、十二烷基硫酸鈉(SDS)、噻唑藍(lán)(MTT)均購自Sigma公司。新生牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品。總抗氧化能力(TAOC)和丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，用UV-VIS 756MC分光光度計檢測。胰島素由蘭州市中國人民解放軍第一醫(yī)院檢驗(yàn)科測定。

1.3 儀器 微孔板分光光度計(Power Wave X BIO-TEX INSTRUMENTS.INC)，GC-1200 γ 放射免疫計數(shù)儀(合肥)，倒置顯微鏡(OLYMPUS CKX41)，EPPENDORF 5810R型臺式冷凍離心機(jī)(德國艾本德股份公司)，CO2孵箱(inCu safe copper ALLOY STAINLESS)，SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化廠)。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%新生牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺，1 mmol/L 丙酮酸鈉，50 μmoL/L β-巰基乙醇，5.6 mmol/L 葡萄糖，1×105IU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2及飽和濕度的恒溫箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代一次。

1.4.2 檳榔堿對INS-1細(xì)胞胰島素釋放的影響 將密度為1×105/ml的INS-1細(xì)胞懸液接種至96孔培養(yǎng)板，隨機(jī)分為正常對照組、檳榔堿組(1 ×10－5mol/L、1 ×10－6mol/L、1×10－7mol/L)，每組6個復(fù)孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將上述各組藥物加入各孔，12 h后收集細(xì)胞上清，放射免疫法檢測胰島素的釋放量。

1.4.3 檳榔堿對INS-1細(xì)胞增殖活力的影響 如1.4.2方法制備細(xì)胞懸液并分組，并設(shè)空白調(diào)零孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，各孔分別加5 mg/ml MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加10%SDS于37℃放置過夜后，用酶標(biāo)儀測定OD570nm值。

1.4.4 檳榔堿對STZ所致INS-1細(xì)胞損傷的保護(hù)和修復(fù)作用

如1.4.2方法制備細(xì)胞懸液，隨機(jī)分為正常對照組、STZ 3 mmol/L組、保護(hù)組(檳榔堿1×10－5mol/L+STZ、檳榔堿1×10－6mol/L+STZ、檳榔堿 1 × 10－7mol/L+STZ)與修復(fù)組(STZ+檳榔堿 1×10-5mol/L、STZ+檳榔堿 1×10－6mol/L、STZ+檳榔堿1×10－7mol/L)，每組6個復(fù)孔，并設(shè)空白調(diào)零孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，保護(hù)組將上述藥物加入各孔，繼續(xù)培養(yǎng)12 h;修復(fù)組先加3 mmol/L STZ作用6 h再加檳榔堿作用6 h，隨后收集細(xì)胞上清，用放射免疫法測其胰島素的釋放量，同時用MTT法測其各孔的OD值。

1.4.5 檳榔堿對INS-1細(xì)胞生成MDA和T-AOC能力的影響

如上述方法制備細(xì)胞懸液，隨機(jī)分為正常對照組、STZ組、保護(hù)組(檳榔堿1×10－6mol/L+STZ)與修復(fù)組(STZ+檳榔堿1×10－6mol/L)，每組6個復(fù)孔。收集細(xì)胞上清，按照試劑盒說明書采用TBA法測定MDA的含量，比色法測定T-AOC的含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各項指標(biāo)均以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 檳榔堿對INS-1細(xì)胞增殖活力和胰島素釋放的影響 與正常對照組比較，檳榔堿顯著促進(jìn)了INS-1細(xì)胞的增殖活力和胰島素釋放量，但其濃度效應(yīng)關(guān)系不明顯。見表1。

表1 檳榔堿對INS-1細(xì)胞增殖活力和胰島素釋放的影響(± s，n=6)

表1 檳榔堿對INS-1細(xì)胞增殖活力和胰島素釋放的影響(± s，n=6)

與正常對照組比較:1)P＜0.01

組別 OD值 胰島素釋放量(μIU/L正常對照組)0.347±0.015 1.17±0.09檳榔堿組(1×10－5mol/L) 0.439±0.0181) 2.95±0.351)(1×10－6mol/L) 0.400±0.0121) 3.29±0.411)(1×10－7mol/L) 0.389±0.0181) 3.10±0.531)

2.2 檳榔堿對STZ致INS-1細(xì)胞損傷的保護(hù)和修復(fù)作用 與正常對照組比較，STZ組胰島素釋放量及OD值明顯降低;與STZ組比較，保護(hù)組和修復(fù)組的OD值和胰島素釋放量顯著升高，說明檳榔堿對STZ所致INS-1細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)和修復(fù)作用。見表2。

2.3 檳榔堿對INS-1細(xì)胞MDA生成和T-AOC能力的影響

與正常對照組比較，STZ組MDA含量顯著升高，而T-AOC顯著降低;與STZ組比較，檳榔堿保護(hù)組和修復(fù)組MDA含量均顯著降低，而T-AOC含量均顯著升高，說明STZ致INS-1細(xì)胞損傷可能是通過提高M(jìn)DA的生成量和降低細(xì)胞T-AOC來實(shí)現(xiàn)的。見表3。

表2 檳榔堿對STZ致INS-1細(xì)胞損傷的保護(hù)和修復(fù)作用( ± s，n=6)

表2 檳榔堿對STZ致INS-1細(xì)胞損傷的保護(hù)和修復(fù)作用( ± s，n=6)

與正常對照組比較:1)P＜0.01;與STZ組比較:2)P＜0.01;下表同

組別 OD值 胰島素釋放量(μIU/L)正常對照組0.256±0.021 7.940±0.459 STZ組(3 mmol/L) 0.146±0.0211) 1.198±0.4271)保護(hù)組(1×10－5mol/L+STZ) 0.186±0.0141)2) 6.033±0.8631)2)(1×10－6mol/L+STZ) 0.185±0.0131)2) 7.302±0.4962)(1×10－7mol/L+STZ) 0.165±0.0131) 4.388±1.0681)2)修復(fù)組(STZ+1×10－5mol/L) 0.258±0.0262) 9.074±1.0871)2)(STZ+1×10－6mol/L) 0.222±0.0512) 5.210±0.4431)2)(STZ+1×10－7mol/L) 0.205±0.0321) 3.717±0.7861)2)

表3 檳榔堿對INS-1細(xì)胞MDA生成和T-AOC能力的影響(± s，n=6)

表3 檳榔堿對INS-1細(xì)胞MDA生成和T-AOC能力的影響(± s，n=6)

組別 MDA(nmol/ml) T-AOC(kU/L)正常對照組3.16±0.39 2.43±0.27 STZ組 10.23±0.601) 1.30±0.221)保護(hù)組 4.05±0.622) 2.01±0.271)2)修復(fù)組 3.62±0.562) 2.17±0.242)

3 討論

氧化應(yīng)激是機(jī)體在遭受有害刺激后，產(chǎn)生了過量的活性氧簇(ROS)〔4，5〕，超出了系統(tǒng)對其的消除能力，過剩的 ROS 對細(xì)胞的DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等造成巨大的損傷，同時也影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致胰島素基因表達(dá)障礙，從而降低胰島素分泌量，導(dǎo)致糖尿病〔6，7〕。STZ可以直接產(chǎn)生ROS，被廣泛的用來制作糖尿病模型。由于胰島β細(xì)胞與機(jī)體其他細(xì)胞相比，細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶等抗氧化水平較低。因此，也更容易受到ROS的損傷。ROS包括活性氧自由基及在細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境能產(chǎn)生自由基的各種物質(zhì)，如超氧陰離子、過氧化脂質(zhì)、過氧化氫以及羥自由基等。ROS可以攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，并因此形成脂質(zhì)過氧化物，其代謝產(chǎn)物MDA是一種有害物質(zhì)，可作為評價脂質(zhì)過氧化反應(yīng)強(qiáng)弱的指標(biāo)〔7〕。從實(shí)驗(yàn)中可以看到，STZ組顯著降低了胰島素的釋放，提高了MDA的生成，并降低了T-AOC能力。與STZ組比較，保護(hù)組和修復(fù)組胰島素釋放量均顯著升高，MDA含量顯著降低，而T-AOC顯著升高。說明檳榔堿對STZ致INS-1細(xì)胞損傷的保護(hù)和修復(fù)作用可能是通過抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物生成，提高細(xì)胞的總抗氧化能力實(shí)現(xiàn)的。

另外，與正常對照組比較，高、中、低三個劑量的檳榔堿均顯著促進(jìn)INS-1細(xì)胞的增殖活力和胰島素釋放，但是究竟檳榔堿是通過何種機(jī)制來完成這種功能還有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明檳榔堿明顯促進(jìn)了INS-1細(xì)胞的增殖活力和胰島素釋放，且對STZ損傷的INS-1細(xì)胞具有一定的保護(hù)和修復(fù)作用，為檳榔堿治療糖尿病提供了一定的理論依據(jù)，而檳榔堿對STZ致INS-1細(xì)胞損傷的保護(hù)和修復(fù)作用以及檳榔堿對INS-1細(xì)胞增殖活力和胰島素釋放的影響機(jī)制仍需進(jìn)一步的深入研究。

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