原花青素對(duì)STZ致胰島細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

趙 麗 陳紅梅 藺美玲 劉世雄 李中平 王志強(qiáng) 張小郁 鄭天珍

(蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與心理學(xué)研究所，甘肅 蘭州 730000)

原花青素(Proanthocyanidins，PC)，是一種有著特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮的總稱。按聚合度大小，二至四聚體稱為低聚原花青素(oligoneric proanthocyanidins)，五聚體以上稱為高聚原花青素(procyanidolic polymers)。1961年德國(guó)的Karl等從山楂新鮮果實(shí)的提取物中首次分離所得，以后人們又相繼在葡萄、山楂、花生、銀杏等植物中發(fā)現(xiàn)了原花青素的存在〔1〕。由于藥理研究已經(jīng)證實(shí)PC具有很強(qiáng)的抗氧化活性，且Faria〔2〕和Silva等〔3〕研究都顯示原花青素從單體到五聚體隨著聚合度的增加，抗氧化活性也隨之增加，使得人們對(duì)PC的開發(fā)和利用極為重視。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究已證實(shí)PC除具有優(yōu)越的抗氧化活性還具有酶抑制活性、血管保護(hù)活性、抗炎、抗輻射及抗腫瘤多種活性等，已在藥品、保健品和化妝品中得到廣泛應(yīng)用〔4，5〕，是一種極具發(fā)展前景的天然植物提取物。Qa'Dan等〔6〕研究表明，原花青素可以降低血脂，抑制胰島β細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胰島素分泌。涂獻(xiàn)玉等〔7〕研究顯示PC能夠降低糖尿病小鼠的血脂含量，提高胰島分泌功能，有利于改善糖尿病癥狀和減少糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生，但有關(guān)PC對(duì)胰島細(xì)胞保護(hù)作用的研究報(bào)道甚少。本研究利用大鼠胰島素瘤細(xì)胞作為研究對(duì)象，旨在細(xì)胞水平上初步探討原花青素對(duì)鏈脲佐菌素?fù)p傷的胰島細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 大鼠胰島素瘤細(xì)胞(INS-1)購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心;原花青素(純度＞98%)購(gòu)于天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司;RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品;新生牛血清，杭州四季青生物工程有限公司產(chǎn)品;鏈脲佐菌素(STZ)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、噻唑藍(lán)(MTT)，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;胰島素放射免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)自山東三維診斷技術(shù)有限公司;丙二醛(MDA)試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) INS-1細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)液內(nèi)含10%新生牛血清，1 mmol/L丙酮酸鈉，2 mmol/L L-谷氨酰胺，50 μmoL/L β-巰基乙醇，5.6 mmol/L 葡萄糖，1 ×105IU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素。細(xì)胞置于37℃，5%CO2及飽和濕度的恒溫箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞存活率 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的INS-1細(xì)胞用0.25%的胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，以1×105的細(xì)胞密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入細(xì)胞懸液100 μl，隨機(jī)分為為正常對(duì)照組、STZ(3 mmol/L)組、PC保護(hù)組(1～5組)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白調(diào)零組。培養(yǎng)24 h后，STZ組、PC保護(hù)組分別加入STZ溶液，使其終濃度為3 mmol/L，PC保護(hù)組(1～5組)同時(shí)加入不同濃度的PC溶液，使其終濃度分別為 6.25、12.5、25、50、100 μg/ml，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 12 h，然后各孔分別加入終濃度為5 mg/ml的MTT溶液，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，各孔分別加入10%SDS溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置過夜后，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm。細(xì)胞的存活率是以對(duì)照組的細(xì)胞存活率為100%，各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞的存活率%=(各實(shí)驗(yàn)組的OD值/對(duì)照組的OD值)×100%。

1.4 放免法檢測(cè)胰島素分泌量 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的INS-1細(xì)胞用0.25%的胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，以1×105的細(xì)胞密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入細(xì)胞懸液200 μl，隨機(jī)分為為正常對(duì)照組、STZ(3 mmol/L)組、PC保護(hù)組(1～5組)，每組6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，STZ組、PC保護(hù)組分別加入STZ溶液，使其終濃度為3 mmol/L，PC保護(hù)組(1～5組)同時(shí)加入不同濃度的PC溶液，使其終濃度分別為6.25、12.5、25、50、100 μg/ml，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 12 h 后，取細(xì)胞上清液，用放免法測(cè)其胰島素的釋放量。

1.5 比色法檢測(cè)MDA含量和T-AOC活性 將INS-1細(xì)胞按1.4的方法分組培養(yǎng)后，取細(xì)胞上清液，根據(jù)試劑盒的要求進(jìn)行操作，用比色法測(cè)定吸光度，按試劑盒的要求計(jì)算MDA含量和T-AOC活性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各項(xiàng)指標(biāo)均以±s表示，各組之間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PC對(duì)STZ損傷INS-1細(xì)胞存活率的影響 處理培養(yǎng)后的正常對(duì)照組、STZ(3 mmol/L)組、PC保護(hù)組(1～5組)的INS-1細(xì)胞的存活率用MTT法測(cè)定，測(cè)定各組的OD值，并計(jì)算細(xì)胞存活率，見表1。

STZ組中的細(xì)胞從鏡下觀察明顯出現(xiàn)了細(xì)胞體積的縮小，細(xì)胞間隙增大，形態(tài)變圓，從表1中發(fā)現(xiàn)，STZ組細(xì)胞存活率明顯低于正常對(duì)照組與STZ組相比，不同濃度的PC各組的細(xì)胞存活率均有增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01);并且PC濃度達(dá)到25 μg/ml時(shí)，PC保護(hù)組明顯呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.2 PC對(duì)STZ損傷INS-1細(xì)胞胰島素釋放量的影響 通過放免法檢測(cè)了PC對(duì)STZ損傷INS-1細(xì)胞胰島素釋放量的影響，從表1中發(fā)現(xiàn)，STZ組的胰島素釋放量明顯低于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);在PC保護(hù)組(1～5組)中，對(duì)應(yīng)的胰島素釋放量均高于STZ組，但是只有當(dāng)PC的濃度達(dá)到12.5 μg/ml時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，P ＜0.01)。

2.3 PC對(duì)STZ損傷INS-1細(xì)胞的MDA含量，T-AOC活性的改變 PC對(duì)STZ損傷INS-1細(xì)胞的MDA含量，T-AOC活性的改變見表2。由表2可知，STZ組的細(xì)胞在加入STZ后，損傷程度與正常對(duì)照組比較，MDA含量的改變差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，在PC(1～5)組中，當(dāng)PC組的濃度高于12.5 μg/ml時(shí)，MDA含量的改變與STZ組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，但各濃度組之間并沒有出現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系。而STZ組的細(xì)胞在加入STZ后，T-AOC活性的改變與正常對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在PC(1～5)組中，當(dāng)PC 的濃度為25、50、100 μg/ml時(shí)，T-AOC 活性的改變與 STZ 組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。但這3個(gè)濃度組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 原花青素對(duì)INS-1細(xì)胞增殖和胰島素釋放量的影響(±s)

表1 原花青素對(duì)INS-1細(xì)胞增殖和胰島素釋放量的影響(±s)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.05，P＜0.01;與 STZ組比較:3)P＜0.05，4)P ＜0.01;下表同

組別 劑量(μg/ml) OD值 存活率(%)胰島素釋放量(μIU/ml)正常對(duì)照組0 0.547±0.017 100 8.376 7±2.113 4 STZ組 0 0.362±0.016 66.3±0.0592)5.063 3±0.814 52)PC-1組 6.25 0.411±0.028 75.4±0.0763) 6.006 7±1.166 34 PC-2組 12.5 0.429±0.055 79.0±0.1324)6.741 7±0.976 53)PC-3組 25 0.511±0.006 93.7±0.0584)6.858 3±1.179 013 PC-4組 50 0.587±0.033 107.4±0.0584) 7.533 3±1.7044)PC-5組 100 0.647±0.078 119.1±0.1944)8.031 7±1.126 264))

表2 原花青素對(duì)STZ損傷INS-1細(xì)胞保護(hù)作用的影響±s)

表2 原花青素對(duì)STZ損傷INS-1細(xì)胞保護(hù)作用的影響±s)

組別 劑量(μg/ml) MDA釋放量T-AOC正常對(duì)照組0 2.013 7±0.756 4 9.533 3±1.026 3 STZ組 0 6.314 0±3.541 62)3.955 6±3.107 21)PC-1組 6.25 4.607 5±1.981 2 5.316 7±2.340 2 PC-2組 12.5 3.071 7±1.083 43) 5.583 3±2.680 7 PC-3組 25 2.901 0±0.904 53)9.216 7±4.317 93)PC-4組 50 2.719 0±1.076 43)10.916 7±2.399 74)PC-5組 100 2.207 1±1.320 43)12.800 0±3.890 74)

3 討論

糖尿病是由于胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足以及胰島素抵抗導(dǎo)致的以糖代謝紊亂為主的全身性代謝疾病。胰島素抵抗與胰島β細(xì)胞功能缺陷是糖尿病發(fā)生的主要機(jī)制。目前普遍認(rèn)為，胰島β細(xì)胞功能障礙是2型糖尿病發(fā)生的必要條件，而胰島β細(xì)胞凋亡是造成INS分泌能力絕對(duì)下降的重要因素，在2型糖尿病的發(fā)病中扮演了重要的角色〔8，9〕。

正常生理狀態(tài)時(shí)，機(jī)體內(nèi)活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生與消除處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。Brownlee〔10〕提出的統(tǒng)一機(jī)制學(xué)說認(rèn)為，高糖環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)過多生成的氧自由基可以激活多元醇、晚期糖基化終末產(chǎn)物、蛋白激酶C等途徑，而后者反之又促進(jìn)自由基的生成，從而形成惡性循環(huán)，加速ROS的形成。糖尿病患者一方面由于ROS的產(chǎn)生明顯增多，另一方面由于胰島β細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)處于較低的水平，易于發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成胰島β細(xì)胞的凋亡及功能下降，導(dǎo)致胰島素合成分泌減少〔11，12〕而氧自由基又可以損傷胰島細(xì)胞的細(xì)胞核和線粒體，導(dǎo)致胰島素mRNA表達(dá)水平的下降，從而導(dǎo)致胰島素的分泌下降;并且由于自由基的增多造成脂質(zhì)過氧化物損傷細(xì)胞膜，使得胰島素受體被破壞和減少，也導(dǎo)致胰島素分泌水平的降低〔13〕。體內(nèi)過剩自由基和活性氧的產(chǎn)生及引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，都可以誘發(fā)胰島細(xì)胞的損傷、引發(fā)胰島β細(xì)胞的凋亡，從而引發(fā)糖尿病。

由于氧化應(yīng)激和糖尿病之間的關(guān)系，抗氧化治療成為重要的手段。目前臨床上使用的抗氧化劑主要為維生素E，維生素C及α-硫辛酸〔14〕，但是療效并不如預(yù)期的那么好。PC是迄今為止發(fā)現(xiàn)的有效的自由基清除劑之一，Bagchi〔15～17〕等人研究證實(shí)PC具有高度生物學(xué)活性，體內(nèi)體外均能夠有效清除自由基，減少自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化及損傷，其對(duì)組織細(xì)胞的保護(hù)作用明顯高于維生素E和維生素C。國(guó)內(nèi)外的研究已證明原花青素具有促胰島素分泌的功能〔6〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也已證明PC可以顯著升高2型糖尿病大鼠血清SOD、降低MDA，能夠降低2型糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激水平，對(duì)2型糖尿病有一定的預(yù)防和治療作用〔18，19〕。

本研究結(jié)果顯示，不同濃度的PC作用于STZ損傷的胰島β細(xì)胞后，胰島β細(xì)胞的存活率顯著提高，并呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，從胰島素的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，單純的STZ作用組，胰島素的分泌量明顯降低，而PC保護(hù)組，濃度在12.5 100 μg/ml之間的INS-1細(xì)胞胰島素分泌量明顯提高，說明PC能夠有效的維護(hù)胰島β細(xì)胞的存活率和功能。

MDA是脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物，可作為評(píng)價(jià)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)強(qiáng)弱的指標(biāo)，降低MDA的含量則能起到保護(hù)細(xì)胞的作用;同時(shí)體內(nèi)存在抗氧化系統(tǒng)，可以清除體內(nèi)產(chǎn)生的各種活性氧，以阻止活性氧誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，STZ組MDA的生成明顯提高，而T-AOC的含量則降低。與STZ組比較，當(dāng)PC保護(hù)組濃度高于12.5 μg/ml時(shí)MDA含量明顯降低，而當(dāng)濃度高于25 μg/ml時(shí)T-AOC活性明顯升高，說明PC對(duì)STZ致INS-1細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用，能夠抑制MDA的生成，保護(hù)INS-1細(xì)胞，同時(shí)也可以提高INS-1細(xì)胞的總抗氧化能力，使細(xì)胞清除自由基的能力增強(qiáng)，減少了MDA的含量，降低了STZ對(duì)INS-1細(xì)胞的損傷程度，最終促進(jìn)了INS-1細(xì)胞胰島素分泌量的增加。

綜上所述，PC能夠?qū)TZ損傷的INS-1細(xì)胞起到有效的保護(hù)作用，可以促進(jìn)STZ損傷的INS-1細(xì)胞分泌胰島素，這可能與PC提高STZ損傷的INS-1細(xì)胞的總抗氧化能力，增強(qiáng)細(xì)胞清除自由基的能力，提高細(xì)胞存活率，增強(qiáng)細(xì)胞活性的作用有關(guān)。PC保護(hù)STZ損傷的INS-1細(xì)胞及促進(jìn)細(xì)胞分泌胰島素的作用機(jī)制仍在進(jìn)一步的探討中。

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