益氣增敏方對2型糖尿病大鼠尿微量白蛋白及胰島素抵抗的影響

薛紅麗 張 曾 王文健 陳偉華 應 健 (復旦大學附屬華山醫院中醫科,上海 200040)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病常見的微血管并發癥,也是慢性腎衰竭的主要原因之一,微量白蛋白尿是DN的早期表現。研究表明,除高血糖、高血壓等因素參與了DN的發病過程外,胰島素抵抗是DN發生發展的獨立危險因素之一。因此,對DN的防治重點除嚴格控制血糖、血壓外,尚需積極改善胰島素抵抗。如何發揮中醫藥的臨床特色,有效延緩DN的病情進展,是目前這一領域的研究熱點之一。本課題組基于對胰島素抵抗相關疾病中醫“聚證”的認識,在臨床上采用益氣增敏方治療早期DN取得了滿意療效。本研究旨在觀察益氣增敏方對2型糖尿病(T2DM)大鼠尿微量白蛋白(MAU)及胰島素抵抗的影響,為進一步的臨床運用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選擇雄性SD大鼠40只,體重180～220 g(上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供)〔動物合格證號:SCKK(滬2008-0016)〕。飼養在室溫(18～25)℃,相對濕度50%～80%的環境條件下,自由進食、飲水。

1.1.2 試劑與儀器 高脂飼料:18%豬油、8%蛋黃粉、2%膽固醇、0.2%膽鹽和71.8%普通基礎飼料(熱量百分比),上海斯萊克實驗動物有限公司制作。鏈脲佐菌素(STZ):Sigma S0130。葡萄糖測定:氧化酶法,試劑盒由北京普利萊基因技術有限公司提供。胰島素測定:酶聯免疫吸附法,試劑盒由Mercodia,Sweden提供。尿微量白蛋白測定:酶聯免疫分析法,試劑盒由上海滬峰生物科技有限公司提供。血糖儀:羅康全活力型(ACCU-CHEK Active)血糖儀。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 選取健康SD雄性大鼠40只,體重180～220 g,適應性飼養1 w后,將大鼠隨機分為2組:普通飼料組(NPD)10只和高脂飼料組(HFD)30只。2組大鼠自由進食、飲水4 w。4 w后,隔夜空腹12 h,高脂組30只大鼠單次腹腔注射鏈脲佐菌素STZ(Sigma)35 mg/kg;普通飼料組10只大鼠腹腔注射相應容量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(p H4.4)。注射3 d后,尾尖采血測隨機血糖,大于等于16.67 mmol/L者作為2型糖尿病造模成功大鼠。造模成功大鼠繼續進食高脂飼料。

1.2.2 藥品制備 益氣增敏方由黃芪、綠豆衣、紫蘇葉、黃柏、生蒲黃、黃連、澤瀉等10位中藥組成。將所有藥物切碎混合,加8倍的水煎3次,分別2、1、1 h。后將藥液濃縮成浸膏,得膏率為36.76%。該浸膏的制作由國家中藥制藥工程技術研究中心完成。浸膏4℃保存,雙蒸水稀釋至所需濃度使用。氯沙坦鉀片(科素亞):杭州默沙東制藥有限公司(批準文號:國藥準字H20030654),研磨成粉狀,灌胃前用雙蒸水配成相應濃度溶液。

1.2.3 實驗分組及給藥方法 將造模成功的30只糖尿病大鼠隨機分為3組,每組10只。2型糖尿病模型組(MOD,n=10),益氣增敏方治療組(YXZM,n=10)和氯沙坦治療組(LOS,n=10)。普通飼料組作為對照組(CON,n=10)。對照組及模型組用相應容積雙蒸水灌胃,益氣增敏方治療組用益氣增敏方2.82 g(生藥)/100 g(體重)灌胃,氯沙坦治療組用氯沙坦20 mg/kg(體重)灌胃,每天1次,連續8 w。實驗過程中除對照組動物予普通飼料外,余實驗組動物均給予高脂飼料。

1.2.4 實驗方法及指標測定

1.2.4.1 標本采集 毛細管眼底靜脈叢采血,血液標本2 500 r/min 4℃離心10 min,分離血清測空腹血清血糖及胰島素。

1.2.4.2 胰島素抵抗指數(HOMA-IR) 內環境穩態模型法胰島素抵抗指數(HOMA-IR)=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(IU/L)/22.5。

1.2.4.3 腹腔注射葡萄糖耐量試驗(IPGTT) 在藥物干預8 w后,每組取5只大鼠,隔夜禁食不禁水12 h,50%葡萄糖溶液(2 g/kg)腹腔注射,于注射前、注射后30、60、120 min時分別毛細管眼底靜脈叢取血,測定血清葡萄糖濃度。

1.2.4.4 胰島素耐量實驗(ITT) 在藥物干預8 w后,每組取5只大鼠,隔夜禁食不禁水 12 h,諾和靈 R(0.5 U/kg)腹腔注射,于注射前、注射后30、60、120 min時分別毛細管眼底靜脈叢取血,測定血清葡萄糖濃度,ITT計算血糖下降相對值(與基礎血糖的比值)。

2 結 果

2.1 益氣增敏方對2型糖尿病大鼠體重、血糖及MAU的影響與CON組大鼠相比,MOD組大鼠體重下降,血糖、MAU明顯升高。經益氣增敏方治療后,與MOD組大鼠相比,YQZM組大鼠體重無明顯改變,血糖、MAU水平明顯下降。經LOS治療后,與MOD組大鼠相比,LOS組大鼠體重、血糖無明顯改變,MAU水平明顯下降。見表1。

表1 益氣增敏方對2型糖尿病大鼠體重、血糖及MAU的影響(±s,n=10)

表1 益氣增敏方對2型糖尿病大鼠體重、血糖及MAU的影響(±s,n=10)

與CON組相比:1)P＜0.05,2)P＜0.01;與 MOD組相比:3)P＜0.05,4)P＜0.01

分組 體重(g) GLU(mmol/L) MAU(μ g/24 h)CON 562.73 ±12.17 3.85±0.33 7.29±1.49 MOD 424.15±18.30 2)17.65±2.222) 51.50 ±6.542)YQZM 445.71±15.54 2)12.16±1.00 2)4)29.64±6.322)3)LOS 407.90±24.69 2)14.51±1.422)31.52±6.432)3)

2.2 益氣增敏方對2型糖尿病大鼠HOMA-IR的影響 與CON組大鼠相比,MOD組大鼠HOMA-IR明顯升高(16.59±2.65 vs 38.79±9.02,P＜0.01)。經益氣增敏方治療后,與MOD組相比,YQZM組大鼠HOMA-IR(22.68±2.37)明顯降低(P＜0.05)。經氯沙坦治療后,與MOD組大鼠相比,LOS組大鼠 HOMA-IR明顯升高(51.43±6.27,P＜0.05)。

2.3 益氣增敏方對2型糖尿病大鼠IPGTT及ITT的影響 藥物干預8 w后,IPGTT實驗顯示,注射葡萄糖30、60、12 min時,模型組血糖與對照組相比顯著升高(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01),表明模型組大鼠糖耐量異常。經益氣增敏方治療后,與模型組相比,各點血糖水平明顯下降(P＜0.05),經氯沙坦治療后,與模型組相比,各點血糖水平無明顯下降。見圖1。ITT實驗顯示,注射胰島素30、60、12 min時,MOD組血糖下降程度與對照組相比顯著降低(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05),提示模型組大鼠胰島素耐量異常。經益氣增敏方治療后,與模型組相比,30、60 min血糖下降程度明顯升高(P＜0.01)。經氯沙坦治療后,與模型組相比,各點血糖水平無明顯下降。見圖2。

圖1 益氣增敏方對2型糖尿病大鼠IPGTT的影響

圖2 益氣增敏方對2型糖尿病大鼠ITT的影響

3 討 論

胰島素抵抗在T2DM和DN的發病機制中占重要地位,MAU與胰島素抵抗存在著密切的關系。研究發現,T2DM患者中胰島素抵抗者較胰島素敏感者MAU的發生率高。在T2DM患者中,MAU陽性者較MAU陰性者有更顯著的胰島素抵抗,而且胰島素抵抗與尿白蛋白排泄率顯著相關。有研究證實T2DM患者胰島素敏感性與尿白蛋白排泄量呈負相關〔1～3〕。

T2DM是以胰島素抵抗為基礎,因胰島素抵抗而不能正常進行葡萄糖代謝,除糖代謝紊亂外,常合并有脂代謝紊亂,類似于中醫理論中的氣化障礙。《素問》:“飲入于胃,游溢精氣,上輸于脾;脾氣散精,上歸于肺,通調水道,下輸膀胱,水精四布,五經并行。”這是中醫對飲食物進入體內后代謝轉化過程的基本認識,其中以“游溢精氣”和“脾氣散精”最為關鍵,都屬于氣化作用。患者氣化不足,精氣不能游溢,脾氣不能散精,物不化正,出現脂肪在腹部堆積,糖分、脂質在血液中積累。在氣化障礙的基礎上,邪熱、濕濁、瘀血乘虛而入,糖代謝、脂代謝紊亂進一步加劇,發展形成DN等糖尿病慢性并發癥〔4〕。

基于這一病機認識,我們臨床使用益氣散聚方用于防治T2DM早期腎病,取得了較好療效。該方由黃芪、黃連、黃柏、生蒲黃、綠豆衣、紫蘇葉、澤瀉等10位中藥組成。方中黃芪甘溫補中,推動氣化,助脾散聚布精;黃連、黃柏苦寒,清熱、瀉火、燥濕,祛濕熱之邪。生蒲黃味甘性微寒,血分藥而兼行氣分,上者可清,下者可利,滯者可行。綠豆衣甘寒,解熱毒。紫蘇葉善行脾胃氣滯,有行氣寬中,和胃止嘔之效。澤瀉利水,滲濕,泄熱。諸藥合用,既有推動氣化之功能,又能清熱、解毒、行氣、散瘀,使精微物質能夠正常布散運化,臟腑功能得以恢復〔5〕。

本實驗采用預先喂飼高脂飲食誘導胰島素抵抗后,再聯合低劑量的STZ部分破壞大鼠的胰島細胞,誘導糖尿病大鼠模型。這種造模方法所誘導的伴胰島素抵抗的大鼠糖尿病更近似于臨床上的T2DM。本實驗發現模型組大鼠尿微量白蛋白較對照組明顯升高,表明該模型符合臨床T2DM早期腎病的臨床特征,這與我們既住的研究結果相一致〔6〕。微量白蛋白尿是DN的早期臨床表現,這一階段如采用適當的治療尚可改善腎臟病變,減少尿蛋白的排出。本研究表明,益氣增敏方可減少模型動物的MAU,改善胰島素抵抗。氯沙坦亦可明顯減少模型大鼠的MAU的作用,但對胰島素抵抗無明顯改善作用。

1 Abdul-Ghani M,Nawaf G,Nawaf F,et al.Increased prevalence of microvascular complications in type 2 diabetes patients with the metabolic syndrome〔J〕.Isr Med Assoc J,2006;8(6):424-5.

2 Aneliya I,Parvanov A,Roberto Trevisan,et al.Insulin Resistance and Microalbuminuria A Cross-Sectional,Case-Control Study of 158 patients with type 2 diabetes and different degrees of urinary albumin excretion〔J〕.Diabetes,2006;55(5):1456-62.

3 Hoehner CM.Association of the insulin resistance syndrome and microalbuminuria among nondiabetic native Americans〔J〕.J Am Soc Nephrol,2002;13(6):1626-34.

4 王文健 .聚證學說的建立和應用〔J〕.中西醫結合學報,2007;5(2):111-4.

5 王文健.論聚證學說及臨證辨治〔J〕.上海中醫藥雜志,2008;42(7):60-2.

6 李佑生,王文健,馬宇瀅,等.復方丹參滴丸防治大鼠早期糖尿病腎臟損害的研究〔J〕.中成藥,2007;29(1):41-5.