血管抑素基因聯合32 P-膠體治療大鼠肝癌的療效

馬 鐸 于 峰 高慧棋 孟 昕 楊志杰 李 勇

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院PET-CT室,黑龍江 哈爾濱 150001)

由于肝癌的發生、發展及轉移的前提是腫瘤血管的形成,所以采用抗腫瘤血管生成的基因治療可以取得良好的治療效果。目前,在基因治療方面國外學者們已取得共識,即盡可能的聯合多種基因、多種治療手段,以期發揮更大、更確切的抑制腫瘤生長和轉移效果〔1,2〕。為此,本研究擬采用血管抑素基因聯合放射性藥物32P-膠體灌注于大鼠肝癌的局部,并觀察其治療效果,分析治療機制,以期為臨床上廣泛應用基因治療提供有力的理論和實踐支持。

1 材料與方法

1.1 試劑及器材 總RNA提取試劑盒(Gibco-BRL公司),TUNEL熒光試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司),FV500 Olympus激光共聚焦顯微鏡(日本),CT機為 GE公司的雙排螺旋CT機。放射性32P-膠體購自北京原子高科有限公司。

1.2 方法

1.2.1 血管抑素基因重組質粒的構建 用Trizol試劑盒提取總RNA。血管抑素基因上游引物為5′-CGAAGCTTGGATCCATGGACCATAAGGAAGTAA-3′,下游引物 5′-TTATGAGCACCGCTTCAGGTTGCAGTAT-3′。按照常規方法進行RT-PCR擴增,擴增后的產物連接入pMD18T克隆載體,構建血管抑素的重組質粒,測序鑒定正確后擴增并提取質粒。

1.2.2 肝癌動物模型的制備及分組治療 雄性Wistar大鼠,體質量為140～150 g,購自吉林大學實驗動物中心。將0.05 ml Walker-256腫瘤細胞(中國醫學科學院藥理研究所提供)接種肝葉,建立肝癌動物模型。7 d后測量腫瘤大小。大鼠分為三組:血管抑素基因治療(治療)組,血管抑素基因 +32P-膠體聯合治療(聯合)組,空白對照(對照)組,每組均為20只。大鼠開腹暴露肝臟及其腫瘤,在腫瘤局部分3個位點注射0.2 ml藥液:血管抑素基因質粒 (20 μ g)〔3〕及血管抑素基因質粒和32P-膠體混合物,對照組于瘤內注射等體積的0.9%氯化鈉0.2 ml。

1.2.3 肝癌內目的基因mRNA表達 基因治療肝癌3 d后,每組隨機選取3只大鼠,分離瘤組織,提取腫瘤總 RNA,采用按cDNA序列設計合成的引物,按照常規方法進行RT-PCR擴增,擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 療效觀察 ①在治療后不同時間測量腫瘤體積(Vt),與治療前腫瘤體積(V0)的比值為腫瘤生長率,用f表示(f=Vt/V0)。比較第7、14、21天各組間腫瘤生長率。②治療21 d后,處死各組大鼠,取腫瘤部位組織,用10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,切片,進行光鏡檢查。免疫組化測定腫瘤微血管密度(MVD):先在40倍顯微鏡下選擇癌灶內微血管最密集的5個區域,然后在200倍鏡下計數每個區域中的血管數,取5個區域的平均數作為該只大鼠腫瘤的MVD值;染色為棕色的血管內皮細胞或血管內皮細胞簇、血管腔和紅細胞不作為判斷微血管的標準〔3〕。③細胞凋亡指數(apoptotic index,AI)的測定:采用TUNEL方法。光鏡下觀察,每張切片隨機選取20個高倍(×400)視野,計數細胞,計算凋亡百分率,計算公式:AI=(陽性細胞數/總細胞數)×100%〔4,5〕。④腫瘤體積生長率測定:前期實驗發現,開腹采用游標卡尺測量時,測量的人為誤差、多次開腹測量后大鼠死亡率增加等原因對結果影響很大,并且比較開腹測量與CT測量結果,發現兩者沒有明顯差異,所以本研究采用CT測量腫瘤大小。CT掃描條件:120 k V,140 mA,FOV 25,層厚、層距均為3 mm。測量方法:CT掃描測量腫瘤體積VT=1/6π(A×B×C)。A為腫瘤最大層面的前后徑,B為腫瘤最大層面左右徑,C為CT所有層面的上下徑。

1.3 統計學方法 應用SPSS13.0統計學軟件,數據資料以±s表示,組間比較采用 χ2檢驗或方差分析。

2 結 果

2.1 目的基因m RNA的表達 三者RT-PCR結果顯示,在治療組和聯合組的大鼠腫瘤內,可見到大小為1 400 bp的血管抑素mRNA特異性表達條帶;而對照組未見到血管抑素mRNA表達。見圖1。

圖1 肝癌組織內血管抑素mRNA的表達

2.2 三組治療后腫瘤體積的比較 治療組和聯合組不同時間的腫瘤生長率均小于對照組(P＜0.01)。聯合組腫瘤生長率最小。見表1。

表1 不同組別腫瘤生長率的變化(±s,n=20)

表1 不同組別腫瘤生長率的變化(±s,n=20)

與空白對照組比較:1)P＜0.01;下表同

組別 7 d 14 d 21 d空白對照組 8.49±1.35 24.65±4.57 44.42±8.79聯合組 2.68±1.431) 4.89±1.97 1) 6.78 ±2.451)治療組 5.98±1.921) 16.58±2.381) 24.75 ±4.541)

2.3 干預后各組的MVD、AI結果比較 經過治療后,治療組和聯合組MVD均低于對照組,具有統計學差異(P＜0.01);治療組和聯合組AI均高于對照組,具有統計學差異(P＜0.01)。表明血管抑素基因主要作用于新生血管內皮細胞。聯合組MVD最低,提示多種具有協同作用的因素相互作用后抑瘤效果最好。見表2。

表2 不同組別治療后MVD和AI的變化(±s,n=20)

表2 不同組別治療后MVD和AI的變化(±s,n=20)

組別 MVD AI空白對照組 61.54±11.36 5.46±1.54聯合組 29.68±3.42 1) 24.85±3.951)治療組 45.93±7.69 1) 15.58±3.481)

3 討 論

肝癌是常見的惡性腫瘤,發生和發展非常復雜,其根本的原因和致病機制仍沒有十分清楚,所以傳統的手術、放療、化療等治療手段至今對于肝癌患者,特別是中晚期患者并不能收到滿意的療效。從上世紀中期人們開始認識到腫瘤生長和轉移需要腫瘤血管的支持,20世紀70～90年代已經證實腫瘤生長與腫瘤血管生長的關系密切,并提出“腫瘤血管平衡開關學說”。這些理論為血管基因治療腫瘤方案的制訂和完善打下堅實的理論基礎。而許多研究〔2,6〕表明,血管抑制基因的長期應用并不引起腫瘤耐藥性,所以抑制腫瘤血管的基因治療研究受到許多學者的重視。在眾多肝癌基因療法中,抑制腫瘤血管的基因直接作用于腫瘤供血血管,能夠明顯抑制腫瘤血管的生長和轉移,從而達到抑制肝癌生長和轉移的效果。本研究的主要意義為明確血管抑素聯合放射性藥物32P-膠體的抑瘤效果,以便為肝癌的基因治療奠定一個堅實的理論和技術基礎。

本研究通過腫瘤體積、腫瘤MVD、腫瘤AI等指標均可證明局部給予的血管抑素可以達到抑制腫瘤生長的目的。這可能與血管抑制基因的產物通過抑制腫瘤新生血管的生長、遷移而達到治療的作用有關〔7,8〕。除單一的血管抑素基因治療能夠產生抑制腫瘤血管生長的作用外,本研究還發現:血管抑素和放射性藥物32P-膠體的聯合應用可產生協同效應,即聯合基因治療的抑瘤效果明顯好于血管抑素基因單一作用。32P-膠體顆粒直徑1～2 μ m,發射純 β射線,最大能量1.71 mev,平均能量0.69 mev,最大射程8 mm,組織內射程2～4 mm,14.28 d,99%能量累積在瘤內注射部位4 mm組織內。32P-膠體注入瘤內后,由于膠體顆粒大,大部分藥物滯留于肝癌腫瘤組織內,腫瘤組織內受到的損傷大于周圍正常組織,從而降低腫瘤的復發。本研究可初步推斷:血管抑素和放射性藥物32P-膠體通過抑制腫瘤血管內皮細胞增殖及遷移達到抑瘤的目的,具有很好的抗肝癌療效。

1 Schmitz V,Tirado-Ledo L,Raskopf E,et al.Effective antitumour monoand combination therapy by gene delivery of angiostatin-like molecule and interleukin-12 in a murine hepatoma model〔J〕.Int J Colorectal Dis,2005;20(6):494-501.

2 Isayeva T,Ren C,Ponnazhagan S.Intraperitoneal gene therapy by rAAV provides long-term survival against epithelial ovarian cancer independently of survivin pathway〔J〕.Gene Ther,2007;14(2):138-46.

3 Yang W,Li XY.Anti-tumor effect of pEgr-interferon-gamma-endostatin gene-radiotherapy in mice bearing Lewis lung carcinoma and its mechanism〔J〕.Chin Med J(Engl),2005;118(4):296-301.

4 Zolota V,Gerokosta A,Melachrinou M,et al.Microvessel density,proliferating activity,p53 and bcl-2 expression in situ ductal carcinoma of the breast〔J〕.Anticancer Res,1999;19(4B):3269-74.

5 Park YN,Kim YB,Yang KM,et al.Increased expression of vascular endothelial growth factor and angiogenesis in the early stage of multistep hepatocarcinogenesis〔J〕.Arch Pathol Lab Med,2000;124(7):1061-5.

6 Sun X,Vale M,Jiang X,et al.Antisense HIF-1 alpha prevents acquired tumor resistance to angiostatin gene therapy〔J〕.Cancer Gene Ther,2010;17(8):532-40.

7 Cavallaro U,Christofori G.Molecular mechanisms of tumor angiogenesis and tumor progression〔J〕.J Neurooncol,2000;50(1/2):63-70.

8 Sim BK,Macdonald NJ,Gubish ER.Angiostatin and endostatin:endogenous inhibitors of tumor growth〔J〕.Cancer Metastasis Rev,2000;19(1/2):181-90.