辛伐他汀對大鼠缺血再灌注損傷后NGF,GAP-43,Nestin表達的影響

王柏欣 阮 洋 賈秀月 陳 梅 王 昕 邱洪斌 王淑秋 (佳木斯大學,黑龍江 佳木斯 54007)

辛伐他汀是一種羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-COA)還原酶抑制劑,能減少膽固醇的生物合成,是一種臨床上廣泛使用的降血脂藥物。最近實驗發現辛伐他汀能減輕腦缺血再灌注損傷,但其機制尚未完全闡明。本課題擬觀察腦缺血再灌注損傷后大鼠腦組織中神經生長因子(NGF),GAP-43,巢蛋白(Nestin)的表達,旨在探討辛伐他汀對腦缺血再灌注的保護作用及機制,并為探索神經損傷修復機制及篩選新藥、建立新的腦損傷治療方法奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 健康成年Wistar大鼠,250～300 g,隨機分為正常組、假手術組、模型組,辛伐他汀組。模型組和辛伐他汀組都應用線栓法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型,缺血時間為30 min,再灌注時間分別為 1、2、3、5、7 d,每個時間點 6 只大鼠。辛伐他汀組在術后第1天開始,予辛伐他汀20 mg/kg灌胃;假手術組及缺血再灌注模型組用相同體積的等滲鹽水灌胃,正常組正常喂養。

1.2 試劑 辛伐他汀由浙江京新藥業股份有限公司提供;FITC標記二抗,NGF、GAP-43、Nestin一抗由上海滬峰生物試劑公司提供;辣根過氧化酶標記二抗,β-actin,由北京中杉提供;預染蛋白Marker由 Fermentas公司提供;PVDF膜由美國Millipore公司提供;ECL發光試劑盒,BCA蛋白濃度檢測試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 建立腦缺血再灌注模型 根據大腦中動脈栓塞法制備腦缺血再灌注模型。稱重,10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉;將動物仰臥位固定(上門齒、四肢遠端用粗線固定于鼠板上),碘伏消毒頸部皮膚,頸部正中切口,分離出頸總動脈、頸外動脈以及頸內動脈,分別接扎頸總動脈及頸外動脈,在頸總動脈距離分叉處將尼龍線導入頸內動脈,插入線栓深度約為(18.0±0.5)mm,感到輕微阻力時立即停止插線。此后縫合傷口,留置線頭于體外,30 min后將線拴提至頸總動脈內,完成再灌注。術后將室溫控制在25℃ ～30℃,視動物狀況注射呋塞咪(速尿)或抗生素預防腦水腫和感染。假手術組除進線1.5 mm外,其余相同。辛伐他汀組在模型制作成功后,在術后第1天開始給藥。

1.3.2 大鼠神經功能Zea-longa評分 (1)無神經功能缺失癥狀、活動正常者,計0分;(2)不能完全伸展對側前爪,計1分;(3)動物爬行時出現向右轉圈(追尾現象),計2分;(4)身體向偏癱側傾倒者,計3分;(5)不能自發行走,意識喪失者,計4分。評分為0分和4分者均被剔除,神經功能評價在取材前進行。

1.3.3 組織切片的制備以及免疫熒光檢測 在實驗結束點將各組動物麻醉,經左心室插管,然后快速灌注生理鹽水約250 ml進行心臟灌洗,雙肺變白后用4%多聚甲醛灌洗固定直到身體僵硬,迅速斷頭取腦,于視交叉后冠狀切取4 mm厚度組織塊,4%多聚甲醛固定,常規脫水,石蠟包埋,切片。分別行HE染色,神經細胞TUNEL染色法,免疫熒光化學法檢測。

1.3.4 腦組織蛋白的提取以及Western印跡檢測 在實驗結束點將各組動物斷頭取腦,于冰上分離缺血側頂葉皮層腦組織,用冰生理鹽水沖洗后,將腦組織置于組織勻漿器中,按照1:10(wt/vol)加入細胞裂解液,置于冰上進行勻漿,多重復碾幾次使腦組織盡量碾碎。完全碾碎后,用移液器將裂解液移至1.5 ml離心管中,然后以12 000 r/min 4℃離心10 min,取上清液置于 -80℃保存。用BCA試劑盒測定蛋白濃度,用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉移到PVDF濾膜,然后用5%脫脂牛奶封閉,特異性一抗,NGF(1∶100),GAP-43(1∶100)、Nestin(1∶100),37℃過夜,辣根過氧化物酶標記二抗 (1∶10 000)孵育2 h后,與ECL發光反應后顯影。用Image pro plus圖像處理系統分析熒光圖片的平均熒光強度。

2 結 果

2.1 激光共聚焦結果分析 正常組、假手術組大鼠熒光強度都很弱,兩組之間比較無顯著性差異(P＞0.05)。模型組與辛伐他汀組各亞組在缺血再灌注后1 d開始升高,在7 d達到高峰;辛伐他汀組與模型組在相同時間點比較,NGF、Nestin、GAP-43的熒光強度明顯增強,差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1 ～表3,圖1～圖3。

表1 GAP-43的熒光強度的表達 ±s,n=6,平均熒光強度)

表1 GAP-43的熒光強度的表達 ±s,n=6,平均熒光強度)

與假手術組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 1 d 2 d 3 d 5 d 7 d正常組 0.002 713 ±0.000 12 0.002 713 ±0.000 12 0.002 713 ±0.000 12 0.002 713 ±0.000 12 0.0027 14 ±0.000 12假手術組 0.003 154 ±0.000 167 0.003 154 ±0.000 167 0.003 154 ±0.000 167 0.003 154 ±0.000 167 0.003 154 ±0.000 167模型組 0.011 813 ±0.000 792 1) 0.020 565 ±0.001 0571) 0.039 812 ±0.008 8411) 0.060 73 ±0.009 7371) 0.082 41 ±0.0147 63 1)辛伐他汀組 0.021 367 ±0.006 3841)2) 0.040 097 ±0.007 7681) 0.063 60 ±0.008 9351)2) 0.081 71 ±0.003 441)2) 0.147 081 ±0.003 521)2)

表2 NGF熒光強度的表達(±s,n=6,平均熒光強度)

表2 NGF熒光強度的表達(±s,n=6,平均熒光強度)

與假手術組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 1 d 2 d 3 d 5 d 7 d正常組 0.003 065 ±0.000 14 0.003 066 ±0.000 14 0.003 065 ±0.000 14 0.003 066 ±0.000 14 0.0030 65 ±0.000 14假手術組 0.002 835 ±0.000 321 0.002 835 ±0.000 321 0.002 835 ±0.000 321 0.002 835 ±0.000 321 0.002 835 ±0.000 321模型組 0.010 227 ±0.001 121 1) 0.022 078±0.006 5671) 0.041 891 ±0.001 158 41) 0.074 107 ±0.034 0571) 0.100 335 ±0.019 4031)辛伐他汀組 0.018 746 ±0.002 7041)2) 0.040 554 ±0.003 7471)2) 0.060 146 ±0.001 060 41)2) 0.109 431 ±0.029 8381)2) 0.145 845 ±0.029 1661)2)

表3 Nestin的熒光強度表達±s,n=6,平均熒光強度)

表3 Nestin的熒光強度表達±s,n=6,平均熒光強度)

與同時間段假手術組比較:1)P＜0.05;與同時間段模型組比較:2)P＜0.05

組別 1 d 2 d 3 d 5 d 7 d正常組 0.003 888 ±0.000 998 0.003 114 ±0.000 374 3 0.003 114 ±0.000 374 0.003 114 ±0.000 374 0.003 114 ±0.000 374假手術組 0.003 822 3 ±0.000 986 0.003 823 ±0.000 986 0.003 563 ±0.000 857 0.003 546 ±0.000 857 0.002 999 ±0.001 548模型組 0.010 79±0.001 5211) 0.024 863 ±0.002 81) 0.041 324 ±0.001 4471) 0.063 386±0.001 641) 0.089 475 ±0.010 0011)辛伐他汀組 0.020 268±0.0008281)2) 0.042 096±0.002 061)2) 0.069 788 ±0.000 9241)2) 0.094 081 ±0.001 9771)2) 0.133 867 ±0.011 9321)2)

2.2 Western印跡結果比較 正常組、假手術組大鼠腦組織表達量都很弱,兩組之間比較無顯著性差異(P＞0.05)。模型組與辛伐他汀組在缺血再灌注后1 d開始升高,在7 d達到高峰;辛伐他汀組與模型組在相同時間點比較,NGF、Nestin、GAP-43的表達量明顯增強,差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖4～圖6。

圖1 GAP-43激光共聚焦結果

圖2 NGF激光共聚焦結果

圖3 Nestin共聚焦結果

圖4 各組GAP-43表達

圖5 各組NGF表達

圖6 各組Nestin表達

3 討 論

近年來研究發現,腦缺血損傷可誘導內源性神經干細胞的增殖〔1〕,巢蛋白(Nestin)是神經干細胞特異表達的中間絲蛋白中的第Ⅵ類中間絲蛋白,作為神經干細胞的標記物,Nestin是一種獨特的神經干細胞特異性抗原,在神經胚胎發育過程中不斷增殖的神經上皮干細胞中短暫地表達,在正常成年動物腦中僅在室管膜下層、內皮細胞和脈絡膜中有表達。研究表明,在腦損傷及腦缺血時Nestin在膠質細胞中迅速表達,是中樞神經系統早期損傷的標志物〔2〕。還有研究表明,Nestin被中樞神經系統和周圍神經系統大多數增殖活躍的前體細胞所表達,發育成熟的神經系統Nestin表達降低,而損傷的神經系統Nestin表達又重新增高〔3〕。因此,探討腦缺血損傷后Nestin的表達情況,有助于了解腦缺血后的神經修復機制

GAP-43是神經組織特異性磷酸蛋白,分布于神經元、再生的施萬細胞和神經膠質細胞,被認為是神經元軸突生長發育和可塑性的分子標記物〔4,5〕。神經生長相關蛋白GAP-43可促進神經細胞生長、軸突再生和突觸重構。神經損傷與再生時,軸突內GAP-43的含量可增加20～100倍〔6,7〕,為神經元軸突的修復和再生提供了足夠的營養供給。

NGF是一組由多種細胞分泌的對神經組織起特殊營養作用的蛋白質或多肽分子,是神經營養因子家族成員之一。研究表明,NGF不僅具有中樞神經系統營養因子的作用,而且能促進受損神經元的再生,改善神經元的病理狀態〔8〕,亦對缺血、缺氧后神經損傷具有重要的保護和修復作用〔9〕。

有報道認為他汀類藥可能通過多種途徑、多種機制保護缺血腦組織、挽救缺血半暗帶〔10〕。本研究結果顯示,缺血再灌注損傷后,NGF、GAP-43、Nestin表達均增加,說明損傷可誘導NGF、GAP-43、Nestin的合成;辛伐他汀可顯著上調大鼠缺血腦組織中NGF、GAP-43、Nestin的表達,表明辛伐他汀可以通過上調NGF、GAP-43、Nestin的表達,減輕缺血損傷,從而起到神經保護作用。

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4 Wang XY,Zhang JT.Effects of ginsenoside Rglonsynaptic plasticity of freely moving and its mechanism of action 〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2001;22(7):1157-62.

5 Hassiotis M,Ashwell KW,Marotte LR,et al.GA P-43 Immunoreactivity in the brain of the developing and adult walla〔J〕.Anat Embr,2002;206(1-2):97-118.

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7 Carrasco J,Penkowa M,Giralt M,et al.Role of metallothionein-III following central nervous system damage〔J〕.Neurobiol Dis,2003;13(1):22-36.

8 Snider WD,Johnson EM.Neurotrophic molecules〔J〕.Ann Neurol,1989;26:489-93.

9 Korsching S.The role of nerve growth factor in the CNS〔J〕.TiNS,1986;7:487.

10 謝 坤,李 勇.他汀類藥物的多效性研究〔J〕.世界臨床藥物,2005;26(10):589-91.