蝦青素對Aβ25～35誘導小鼠皮層神經元損傷的保護作用

陸亞鵬 劉思園 朱 俐 (南通大學航海醫學研究所,江蘇 南通 22600)

阿爾茨海默病(AD)是一種病因未明的神經退行性疾病,Aβ在腦組織中的異常增加和沉積是AD主要的病理改變。Aβ通過誘導氧化應激、炎癥反應等多種神經毒性,引起海馬和皮層等處膽堿能神經元的退變,可能是導致AD患者記憶和認知障礙的主要原因〔1〕。蝦青素(AST)屬于類胡蘿卜素,具有較為突出的抗氧化和抗炎活性〔2〕,能夠穿透血腦屏障〔3〕。為了考察蝦青素在 AD治療中的應用潛力,本研究首次以 Aβ25～35誘導小鼠皮層神經元損傷為模型研究蝦青素對Aβ的神經毒性的抑制作用,并為深入研究蝦青素的神經保護作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 CO2培養箱(5400,NAPCO公司),全自動酶標儀(Elx800,BiO-TEK公司),正置熒光顯微鏡(DM4000B,Leica公司)、倒置熒光顯微鏡(DMIRB,Leica公司)。Neurobasal Medium/B27、DMEM 培養基(Invitrogen公司),胰蛋白酶 (Cell Signaling Technology 公司),Aβ25～35、AST、多聚賴氨酸、Hoechst 33342、DCFH-DA、MTT、羅丹明123(Sigma公司),DMSO(Amresco公司)。其他試劑均為分析純。

1.2 小鼠皮層神經元的培養 取胎齡為13～15 d的ICR小鼠,無菌條件下分離出大腦皮層,在 D-Hank′s平衡鹽溶液中漂洗3遍,徹底剔除腦膜和表面血管,剪碎后用終濃度為0.125%胰蛋白酶37℃消化10 min,用含15%胎牛血清的DMEM完全培養基終止消化,調整細胞密度為1×106個/ml,接種于預先鋪有L-多聚賴氨酸的96孔或24孔培養板中,96孔培養板每孔100 μ l,24 孔培養板每孔 1 000 μ l。 置 37℃、5%CO2培養箱培養24 h后,用Neurobasal Medium/B27全部換液,培養3 d后加入鹽酸阿糖胞苷(終濃度為10-5mol/L)作用24 h抑制非神經細胞的生長,以后每隔2～3 d換液1次,培養7 d后用于實驗。實驗前用神經元特異性烯醇酶(NSE)免疫熒光標記,隨機計數300個相鄰細胞,證實神經元純度達90%以上。

1.3 Aβ25～35的孵育 將 Aβ25～35溶于滅菌蒸餾水中,配成濃度250 μ mol/L的母液分裝,于-20℃凍存。使用前置入37℃下孵育7d,使其老化、聚集。

1.4 實驗分組 正常組:不加任何處理因素;模型組:取5、10、15、20 μ mol/L 4 個濃度的 Aβ25～35處理細胞 24 h,選擇合適造模濃度;AST 保護組:分 別用 250、500、1 000、2 000、4 000 nmol/L濃度的AST預處理2 h后加入 Aβ25～35共同孵育24 h。

1.5 MTT法測定神經元活力 將細胞(1×105個/ml)接種于96孔板,培養神經元按實驗要求處理后,向96孔板中加入每孔180 μ l Neurobasal無血清培養基和 5 g/L 的 MTT 20 μ l,孵育 4 h后,吸棄上清液,每孔加150 μ l DMSO振蕩10 min,用自動酶標檢測儀,在570 nm波長處測各孔的吸光度(OD)值。相對細胞活力(%)=處理組的OD值/對照組的OD值 ×100%。

1.6 ROS檢測 接種于96孔板中的神經元經實驗處理后,用含10 μ mol/L DCFH-DA熒光探針的培養液于37℃細胞培養箱內孵育20 min。用無血清細胞培養液洗滌細胞3次以去除探針。用自動酶標檢測儀檢測DCF,激發波長488 nm,發射波長525 nm。DCF相對熒光強度(%)=處理組的熒光值/對照組的熒光值 ×100%。

1.7 Hoechst 33342熒光染色檢測細胞凋亡 將生長于24孔培養板內蓋玻片上的神經元,經過不同處理后用0.01 mol/L PBS洗兩遍,加4%多聚甲醛室溫下固定1 h,用0.01 mol/L PBS洗3遍后加入5 mg/L Hoechst工作液,4℃避光孵育1 h,用0.01 mol/L PBS洗3遍后將蓋玻片附有細胞的一面倒扣在滴加10 μ l緩沖甘油的載玻片上。通過正置熒光顯微鏡觀察,正常細胞核呈彌散均勻的熒光,凋亡的細胞核呈團狀或碎塊狀致密濃染的強熒光。計算凋亡細胞的百分率(%)=凋亡細胞核數/總細胞核數×100%。

1.8 線粒體膜電位的測定 線粒體膜電位測定按照本實驗室已建立的方法〔4〕,有少許改動。接種于96孔板中的神經元按實驗要求處理后,加入含1 g/L Rhodarmine123的培養液于37℃孵育15 min,0.01 mol/L PBS洗滌3次,用自動酶標檢測儀506 nm激發波長,529 nm發射波長檢測Rhodarmine123熒光強度。Rhodarmine123相對熒光強度(%)=處理組的熒光值/對照組的熒光值 ×100%。樣品在倒置熒光顯微鏡下觀察,拍照。

2 結 果

2.1 MTT測定結果 預實驗結果顯示AST濃度大于4 000 nmol/L時神經元活力出現下降現象,在250～4 000 nmol/L范圍內神經元活力無明顯變化,表明該濃度范圍對神經元無明顯毒性,因此選擇250～4 000 nmol/L作為本研究AST的處理濃度范圍。經老化處理的Aβ25～35可以劑量依賴性的引起細胞活力下降。 用 5、10、15 和 20 μ mol/L Aβ25～35作用于神經元24 h后,相對細胞活力分別為63.9%±7.4%、46.4%±4.5%、35.2% ±5.4%和18.3%±3.0%,因此本實驗選用10 μ mol/L Aβ25～35來制備神經元損傷模型。MTT測定結果如表 1所示,500～4 000 nmol/L的 AST可明顯拮抗10 μ mol/L Aβ25～35引起的細胞活力下降,其中 2 000 nmol/L 的AST作用效果最為顯著(P＜0.01)。

2.2 ROS水平檢測結果 神經元內ROS水平檢測結果見表1。皮層神經元經10 μ mol/L Aβ25～35處理24 h后細胞內 ROS明顯增加,500～4 000 nmol/L AST預處理能有效防止Aβ25～35誘導的胞內ROS積累,與模型組相比,有顯著性差異(P＜0.01)。

2.3 凋亡檢測結果 Hoechst 33342檢測結果如圖1、表 2所示。正常組神經元細胞核呈彌漫均勻的低強度熒光,而Aβ25～35模型組一些細胞核呈濃染致密的固縮形態和顆粒狀熒光,為凋亡的典型形態。2 000 nmol/L AST處理組,固縮形態和顆粒狀熒光的細胞核顯著減少(P＜0.01)。

2.4 線粒體膜電位 線粒體膜電位的檢測結果如圖2、表2所示。10 μ mol/L Aβ25～35處理皮層神經元24 h導致線粒體膜電位明顯下降,表現為神經元內聚集的Rhodarmine 123明顯減少。膜電位下降是線粒體受損的重要表現,而用2 000 nmol/L AST預處理對神經元的線粒體功能有明顯的保護作用,Rhodarmine 123的熒光值明顯高于模型組 (P＜0.01)。

表1 AST對Aβ25～35誘導小鼠皮層神經元活力下降和胞內ROS水平上升的影響(±s,n=8)

表1 AST對Aβ25～35誘導小鼠皮層神經元活力下降和胞內ROS水平上升的影響(±s,n=8)

與空白對照組比較:1)P＜0.01;與A β25～35模型組比較:2)P ＜0.05,3)P＜0.01

組別 相對細胞活力(%) DCF相對熒光強度(%)空白對照組 100.0±3.1 100.0±4.5 Aβ25～35模型組 48.9 ±3.51) 251.8 ±10.31)AST保護組250 nmol/L 52.8 ±6.0 233.4±13.4 500 nmol/L 60.9±5.12) 174.5 ±12.73)1 000 nmol/L 81.9 ±2.23) 130.0 ±8.03)2 000 nmol/L 91.3±4.73) 125.1 ±13.23)4 000 nmol/L 88.6 ±6.93) 144.7 ±9.73)

圖1 AST對 Aβ25～35誘導小鼠皮層神經元凋亡的影響(bar=20 μ m)

圖2 AST對 Aβ25～3 5誘導小鼠皮層神經元線粒體膜電位損傷的影響(bar=50 μ m)

表2 AST對Aβ25～35誘導小鼠皮層神經元凋亡和線粒體膜電位損傷的影響(±s,n=6)

表2 AST對Aβ25～35誘導小鼠皮層神經元凋亡和線粒體膜電位損傷的影響(±s,n=6)

與空白對照組比較:1)P＜0.01;與 Aβ25～35模型比較:2)P ＜0.01

組別 凋亡率(%) Rhodarmine 123相對熒光強度(%)空白對照組 5.2±1.1 100.0±3.0 Aβ25 ～35模型組 43.9 ±3.51) 51.8 ±6.91)AST保護組 18.3±4.92) 84.1±7.22)

3 討 論

AST具有多種藥理活性,在糖尿病、腫瘤和心腦血管疾病的防治方面有很大的臨床應用潛力〔5〕。作為類胡蘿卜素中唯一被證實能穿透血腦屏障的成員,AST可以對中樞神經系統尤其是對大腦起到保護作用〔6〕。

腦部Aβ的沉積是AD的典型病理特征之一。Aβ由39～43個氨基酸殘基組成,Aβ25～35是其主要的毒性片段,對體外培養及在體的神經細胞均有毒性作用〔7〕。膽堿能神經元退行性病變與 AD密切相關,本研究利用 Aβ25～35誘導小鼠皮層神經元損傷作為AD的細胞模型,能很好地模擬AD的病理特征。

本結果可以說明AST具有保護線粒體膜和酶的功能,能夠維持細胞的穩態,使神經元死亡率明顯降低。Aβ可以通過誘導產生大量的ROS而造成氧化應激損傷。線粒體不僅是細胞中ROS的主要產生場所,也是對氧化損傷非常敏感的細胞器〔8〕。超過正常水平的ROS會影響線粒體膜的性質和功能,損傷線粒體呼吸鏈及其相關代謝酶,導致線粒體膜電位下降、能量代謝受阻、線粒體腫脹、并可釋放細胞色素c等凋亡相關因子,介導細胞死亡〔9〕。本研究發現AST預處理可有效抑制胞內ROS的產生,2 000 nmol/L的AST抑制效果最為明顯,能很好地保護線粒體膜電位不受氧化損傷的影響,抑制神經元凋亡。

AST可能通過多種途徑發揮抗氧化損傷的作用。AST不僅同其他類胡蘿卜素一樣在分子中存在共軛雙鍵鏈,而且在共軛雙鍵鏈末端的3和3′位置有不飽和酮基和羥基,因此具有更強的清除自由基的能力。另外,由于末端羥基的存在,使AST分子兩端親水,中間疏水,能嵌入生物膜的磷脂雙分子層,增加生物膜的機械強度,更好地防止自由基對膜的損傷〔10〕。AST還具有激活內源抗氧化系統的能力,提高超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等內源性抗氧化物酶的表達水平〔3〕。近來有文獻報道,AST能呈劑量依賴性和時間依賴性的上調血紅素加氧酶-1的表達,從而對 Aβ25～35誘導 PC12細胞的損傷起到明顯的保護作用〔11〕。

總之,本文初步確認了AST對AD的神經保護作用機制可能和防止氧化應激損傷和保護線粒體功能有關。但是,Aβ的神經毒性機制和AST防治作用的機制需要深入研究。

1 Nathalie P,Jean-Noel O.Processing of amyloid precursor protein and amyloid peptide neurotoxicity〔J〕.Curr Alzheimer Res,2008;5(2):92-9.

2 楊 艷.蝦青素抗氧化活性機制研究進展〔J〕.國外醫學·衛生學分冊,2008;35(4):231-3.

3 Nakajima Y,Inokuchi Y,Shimazawa M,et al.Astaxanthin,a dietary carotenoid,protects retinal cells against oxidative stress in-vitro and in mice invivo〔J〕.J Pharm Pharmacol,2008;60(10):1365-74.

4 Lu YP,Liu SY,Sun H,et al.Neuroprotective effect of astaxanthin on H(2)O(2)-induced neurotoxicity in vitro and on focal cerebral ischemia in vivo〔J〕.Brain Res,2010;1360:40-8.

5 Hussein G,Sankawa U,Goto H,et al.Astaxanthin,a carotenoid with potential in human health and nutrition〔J〕.J Nat Prod,2006;69(3):443-9.

6 Goswami G,Chaudhuri S,Dutta D.The present perspective of astaxanthin with reference to biosynthesis and pharmacological importance〔J〕.World J Microbiol Biotechnol,2010;26(11):1925-39.

7 張萌濤,錢亦華,楊 杰,等 .丹參酮ⅡA對谷氨酸聯合淀粉樣蛋白誘導細胞損傷的保護作用〔J〕.中國老年學雜志,2009;10(29):2465-8.

8 張榮超,付 于,于建春,等 .β淀粉樣蛋白致線粒體功能障礙的研究現狀〔J〕.中國老年學雜志,2010;30(15):156-8.

9 Galindo MF,Ikuta I,Zhu X,et al.Mitochondrial biology in Alzheimer′s disease pathogenesis〔J〕.J Neurochem,2010;114(4):933-45.

10 Shibata A,Kiba Y,Akati N,et al.Molecular characteristics of astaxanthin and beta-carotene in the phospholipid monolayer and their distributions in the phospholipid bilayer〔J〕.Chem Phys Lipids,2001;113(1-2):11-22.

11 Wang HQ,Sun XB,Xu YX,et al.Astaxanthin upregulates heme oxygenase-1 expression through ERK1/2 pathway and its protective effect against beta-amyloid-induced cytotoxicity in SH-SY5 Y cells〔J〕.Brain Res,2010;1360:159-67.