肺癌中EGFR、VEGF與NET-1的表達及與臨床病理因素的關系

卞偉鋼,胡 平,宋 曙,何 嘯,王傳斌,陳 萍,陳 莉

(1.江蘇省鹽城市第一人民醫院,江蘇鹽城,224005;2.江蘇省南通大學醫學院病理教研室,江蘇南通,226001)

肺癌的發生是多因素綜合作用的結果,在其生長過程中,腫瘤細胞的增殖和血管的新生起著基礎而重要的作用。表皮生長因子受體(EGFR)廣泛存在于哺乳動物的細胞膜上,參與細胞的惡性轉化和增殖,血管內皮生長因子(VEGF)是血管生成的重要促進因子。NET-1是腫瘤增殖相關蛋白,在細胞信號轉導、調節、黏附、移動、增生和分化中起重要作用。

1 臨床資料

收集2004年1月至2006年12月鹽城市第一人民醫院、腫瘤醫院、第三人民醫院手術切除的原發性肺癌組織標本120例。全部病例均行常規病理檢查,明確診斷與臨床分期。120例標本中男性84例,女性36例,男女比例為1∶0.43;年齡34～78歲,中位年齡60歲,<60歲者51例,>60歲者69例。全部患者術前均未接受過化療及放療。取10例肺癌周邊相對正常的肺組織作為對照組,所有組織均用10%福爾馬林固定,常規石蠟包埋,連續切片,作蘇木精-伊紅(HE)及免疫組化染色。

鼠抗人單克隆抗體EGFR、兔抗人多克隆抗體VEGF、SP免疫組化檢測試劑盒購自福州邁新生物技術公司。兔抗人多克隆抗體NET-1由南通大學醫學院病理教研室陳莉教授惠贈,美國舊金山基因生物公司協助合成。

常規脫蠟水化,組織抗原微波修復,10%山羊血清封閉。EGFR、VEGF抗體的工作濃度為1∶50,NET-1抗體的工作濃度為1∶20,免疫組化染色SP法按說明書操作步驟進行,DABH2O2顯微鏡控制下顯色,蘇木精復染,常規脫水中性樹膠封片。使用PBS代替一抗處理的切片作為陰性對照,已知陽性組織切片作為陽性對照。

EGFR的陽性染色定位于腫瘤細胞的胞質或胞膜上、個別位于胞核上呈棕黃色顆粒,VEGF陽性表達定位于腫瘤細胞質內,呈棕黃色或褐色顆粒。光鏡下選擇5個表達EGFR、VEGF相對較多的區域,在高倍鏡視野下每個視野分別計數200個細胞,共計1 000個細胞,按陽性細胞數占腫瘤細胞的比例進行分級:陰性(-)為無棕黃色染色或染色陽性腫瘤細胞數<10%;弱陽性(+)為陽性細胞數10%～25%;中等陽性( )為陽性細胞數25%～50%;強陽性( )為陽性細胞數≥50%。NET-1陽性染色定位于腫瘤細胞的胞質或胞膜上,呈棕黃色顆粒。陽性細胞數<5%為0分,6%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,>75%為4分。染色強度呈淡黃色為1分,黃色為2分,棕黃色為3分。陽性細胞百分比和染色強度兩項積分相乘,0分為(-),1～4分為(+),5～8分為( ),9～12分為( )[1]。

2 結 果

2.1 對照組與肺癌組EGFR、VEGF、NET-1表達情況的比較

EGFR陽性表達于肺癌細胞的胞質或核膜上(圖1-2),VEGF陽性表達于細胞質內(圖3),NET-1陽性表達于肺癌細胞的胞質或胞膜上(圖4)。120例肺癌組織中,EGFR、VEGF、NET-1陽性率分別為 69.16%(83/120)、55.83%(67/120)、85.00%(102/120);對照組10例正常組織中陽性率分別為10.00%(1/10)、0.00%(0/10)、40.00%(4/10)。肺癌組與對照組之間EGFR、VEGF、NET-1的表達差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 EGFR、VEGF、NET-1在肺癌組與對照組中表達的比較

2.2 肺癌組織中EGFR、VEGF、NET-1的表達與臨床病理因素的關系

肺癌組織中 EGFR、VEGF、NET-1的表達與腫瘤的臨床分期、分化程度及有無淋巴結轉移有關(P<0.05),而與患者性別、年齡、病變部位無顯著相關(P>0.05,表2)。

2.3 肺癌組織中EGFR、VEGF、NET-1三者表達的相互關系

120例肺癌組織中 EGFR、VEGF同為陽性表達者52例,同為陰性表達者22例,兩者的表達有相關性(χ2=4.1773,P=0.041),且呈正相關(r=0.2056,P=0.0243,表3)。

120例肺癌組織中NET-1、VEGF同為強陽性表達者27例,同為陰性表達者11例,兩者的表達有相關性(χ2=63.4132,P=0.000),且呈正相關(r=0.5547,P=0.000,表4)。

120例肺癌組織中NET-1、EGFR同為強陽性表達者20例,同為陰性表達者11例,兩者的表達有相關性(χ2=51.8097,P=0.000),且呈正相關(r=0.6107,P=0.000,表5)。

表2 EGFR、VEGF、NET-1的表達與肺癌臨床病理因素的關系

表3 EGFR、VEGF在肺癌組織中表達的相互關系

表4 NET-1、VEGF在肺癌組織中表達的相互關系

表5 NET-1、EGFR在肺癌組織中表達的相互關系

3 討 論

圖1 低分化腺癌EGFR陽性高表達 (SP 400倍)

圖2 高分化鱗癌EGFR陽性高表達 (SP 400倍)

圖3 低分化鱗癌VEGF陽性高表達 (SP 400倍)

已有研究發現[2-3],在多種腫瘤組織中存在EGFR的高表達。本研究發現,肺癌組織中EGFR蛋白的表達較正常組織明顯升高,且其表達強度與-腫瘤組織的分化程度、臨床分期及是否有淋巴結轉移密切相關,與文獻報道一致[4]。由于EGFR酪氨酸激酶是細胞信號傳導的必要條件,因此我們認為在肺癌組織中EGFR與其配體結合后使得酪氨酸激酶磷酸化而激活了酪氨酸激酶,通過催化與肌醇磷脂代謝有關的酶、激酶,調節蛋白磷酸化,促進產生第二信使,導致核內原癌基因c-myc、c-fos表達,刺激了肺癌細胞發生增殖,與肺癌的惡性進展密切相關。

實體腫瘤生長的兩個關鍵過程是腫瘤細胞的增殖和血管生成,目前已知在所有的已知實體腫瘤中均存在VEGF表達的上調[5-6]。本研究顯示,肺癌組織中VEGF蛋白的表達較正常組織明顯升高,且與腫瘤組織的分化程度、臨床分期及是否有淋巴結轉移密切相關,這是由于VEGF一方面可以通過激活Akt通路來增強腫瘤細胞對凋亡的阻抗[7],另一方面可通過與其受體結合,誘導腫瘤內新的血管及淋巴管生成,促進腫瘤細胞的增殖和淋巴道轉移,導致了肺癌的惡性病程及淋巴結轉移。

四聚體超家族(TM4SF)是一組含有4個疏水性跨膜結構域的蛋白,在細胞外形成兩個大小不等的環狀結構,氨基端和羧基端位于胞質內,長度較短。這些分子之間有很多高度保守的序列,并且大多數同源性序列都位于跨膜區域[8]。從1990年發現至今,TM4SF的成員已發展到了25個,NET-1基因是TM4SF家族成員之一,定位于1p34.1,其mRNA全長為1 297 bp,編碼序列為128～853 bp,有241個氨基酸的開放閱讀框[9]。陳莉等[10]通過RT-PCR技術篩檢人類48種組織與相應腫瘤,發現除造血系統組織與相應腫瘤、心、腦、胰不表達外,幾乎所有的人類組織及相應腫瘤均表達NET-1基因。本研究結果提示NET-1作為一種胞質蛋白可能可以傳導細胞分裂的信息和/或引起細胞異向分化或去分化,它的過度表達與細胞增殖有關,可明顯上調肺癌的惡性進展過程。作者分別對 NET-1和VEGF、EGFR進行了相關分析,結果顯示NET-1與后兩者在肺癌中的表達呈兩兩正相關,其原因可能是:一方面NET-1通過自身在細胞分化中所起的作用,促進了腫瘤細胞的增殖,而新生的腫瘤細胞又需要豐富的血供,進而刺激了細胞內VEGF表達的上調,導致血管新生,從而引起了惡性循環;另一方面,盡管TM4SF蛋白的生物學功能不十分清楚,但TM4SF與細胞黏附分子整合素的協同作用可特異性地調控后配體整合素依賴性信號轉導,能影響黏附依賴性下游信號轉導事件,包括細胞蛋白的酪氨酸激酶的磷酸化和絲氨酸、蘇氨酸激酶PKB/c Akt的激活,進而影響細胞的運動和分化。在肺癌的發生、惡性進展中,EGFR作為一種酪氨酸激酶受體在其活化途徑中有受到TM4SF蛋白調控的可能性。

[1] Kawaski H,Altieri D C,Lu C D,et al.Inhibition of apotosis by surviving predicts shorter surviva rates in colorectal cancer[J].Cancer Res,1998,58(22):5071.

[2] Sharma S V,Bell D W,Settleman J,et al.Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer[J].Nat Rev Cancer,2007,7(3):169.

[3] 王瑞娟,張建中,王 萍.EGFR與ERβ在非小細胞肺癌組織中的表達及其臨床意義[J].診斷病理學雜志,2009,16(5):375.

[4] Chandrika J,Piyathilake,Andra R,et a1.Differential expression of growth factors in squamous cell carcinoma and precancerous lesions of the lung[J].Clin Cancer Res,2002,8(3):734.

[5] Waxman D J,Schwartz P S.Harnessing apotosis for improved anticancer gene therapy[J].Cancer Res,2003,63(24):8563.

[6] 潘艷東,黎 靜,李志強.Ki67,VEGF和EGFR的表達與鼻咽癌臨床分期及分化程度的關系[J].廣東醫學,2009,30(7):1095.

[7] Voelkel N F,Vandivier R W,Tuder R M.Vascular endothelial growth factor in the lung[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2006,290(2):L209.

[8] Parkin D M,Bray F,Ferlay J,et al.Global cancer statistics,2002[J].CA Cancer J Clin,2005,55(2):74.

[9] Serru V,Dessen P,Boucheix C,et a1.Seqence and expression of sevennew tetraspans[J].Biochim Biophys Acta,2000,1478(1):159.

[10] 陳莉,李德春,朱遠源.NET-1蛋白表達與肝癌臨床病理因素相關性探討[J].中華病理學雜志,2005,34(9):596.