氯胺酮霧化吸入對哮喘大鼠氣道反應性和炎癥的影響

徐玉民,孫燦林,謝國柱,傅誠章

(1.江蘇省泰州市人民醫院麻醉科,江蘇泰州,225300;2.南京醫科大學第一附屬醫院麻醉科,江蘇南京,210029)

哮喘是一種以嗜酸性粒細胞浸潤為主,多種炎癥細胞參與的慢性氣道炎癥性疾病[1],嗜酸性粒細胞是過敏性及內源性哮喘的標志物,它釋放眾多細胞因子,在過敏性哮喘中發揮重要作用,IL-13可活化嗜酸性粒細胞,延長嗜酸性粒細胞存活時間并呈濃度依賴關系,在哮喘氣道炎癥和氣道高反應發病機制中起著重要作用。氯胺酮是臨床常用的靜脈麻醉藥,一些研究表明[2-3],氯胺酮具有抗炎、舒張支氣管平滑肌的作用,本文旨在探討氯胺酮霧化吸入對哮喘大鼠氣道高反應性和氣道炎癥的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性Brown Norway大鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司),10～12周齡,體重280 g～320 g,SPF級;雞卵蛋白(OVA,美國Sigma公司,V級)、滅活百日咳桿菌菌苗(北京市中國藥品生物制品檢定所);鹽酸氯胺酮注射液(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司);氯乙酰膽堿(上海三愛思試劑公司)。超聲霧化器(德國Boehringer Ingelheim公司),動物肺功能體描箱、呼吸機及AniRes2003分析軟件(北京貝蘭博科技有限公司),大鼠IL-13酶聯免疫吸附檢測試劑盒(美國Biosource公司)。

1.2 哮喘模型建立及氯胺酮霧化吸入

將40只大鼠隨機分成5組,分別為對照組(C組),哮喘模型組(A組),氯胺酮1組(K1組),氯胺酮2組(K2組),氯胺酮 3組(K3組),每組8只。

致敏階段:在第0天和第7天,各組大鼠在胸部皮下注射0.1%卵蛋白加氫氧化鋁100mg PBS混合液1 mL,同時腹腔注射1 mL滅活百日咳桿菌菌苗(6×109)致敏。激發階段及氯胺酮霧化吸入:各實驗組每日霧化吸入液體量為50 mL,用時30 min。A 組于第 14、16、18、20、22、24、26 天 ,霧化吸入 PBS, 于第 15、17、19、21、23、25、27 天霧化吸入1%卵蛋白PBS混合液。K1、K2、K3組于第 14、16、18、20、22、24、26、28 天分別霧化吸入濃度為12.5、25.0、50.0 mg/mL氯胺酮 PBS混合液,于第 15、17、19、21、23、25、27 日霧化吸入 1%卵蛋白進行激發。C組從第14天起每日霧化吸入PBS,連續兩周。在最后1次激發后24 h測定氣道反應性。

1.3 大鼠氣道反應性激發檢測

大鼠用1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉,行氣管切開插管、頸外靜脈穿刺置管,放入密閉的體描箱中,連接小型動物呼吸機行輔助通氣,動物呼吸機參數設置為:呼吸頻率80次/min,吸呼比為1.0 1.5,初始潮氣量為10 mL/kg。每只大鼠分別給予成倍增加的ACH(0、50、100、200 μ g/kg),每次進液量 200 μ L, 兩個相鄰給藥點間隔5 min。采用AniRes2003動物肺功能分析系統測定呼氣阻力(expiratory resistance,Re)。

1.4 支氣管肺泡灌洗液(BALF)檢測

氣道反應性測定后即刻行肺灌注,用PBS緩沖液8 mL分3次于氣管插管處注入,緩慢沖洗右肺,并用手指輕輕按摩肺組織,反復抽吸6次后回收BALF,回收率約80%,BALF收集在EP管中,1 500 r/min離心15 min,取上清液分裝于EP管中,-80℃冰箱保存,采用ELISA法測定BALF中IL-13的濃度,具體步驟嚴格按試劑盒操作說明書進行。沉淀用臺盼藍拒染檢測顯示活細胞占95%以上,用瑞氏一吉姆薩染色法作細胞分類計數。

2 結 果

2.1 各組大鼠氣道反應性變化

各組不同濃度ACH激發后Re增長率見表1。在 ACH 濃度為 50、100、200 μ g/kg 時 K1、K2、K3組與A組Re的增長率差異有統計學意義(P<0.05),與C組Re的增長率差異無統計學意義(P>0.05);在 ACH 濃度為 200 μ g/kg時 K1、K2、K3組與C組Re的增長率差異有統計學意義(P<0.05);各ACH 濃度下K1、K2、K3組之間差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組不同劑量ACH給藥后Re增長率的比較(%)

2.2 各組大鼠BALF中細胞總數及分類計數的比較

與C組相比較,A組BALF中總細胞數、嗜酸細胞和淋巴細胞百分比明顯增高,差異有統計學意義(P<0.01)。與A 組相比,K1、K2、K3組的BALF中總細胞數分別下降46%、53%、41%,差異有統計學意義(P<0.01),K1、K2、K3組BALF中嗜酸細胞和淋巴細胞百分比明顯下降,差異有統計學意義(P<0.05,表2)。

表2 各組BALF中細胞總數及分類計數百分比的比較(%)

2.3 各組大鼠BALF中IL-13濃度的比較

A組肺泡灌洗液IL-13的濃度與C組比較明顯升高(P<0.05)。K1組、K2組、K3組BALF IL-13的濃度和A組比較明顯降低(P<0.05),K1組、K2組、K3組之間比較兩組 BALF IL-13的濃度差異無統計學意義(P>0.05,表3)。

表3 大鼠BALF中IL-13濃度的比較(pg/mL,±s)

表3 大鼠BALF中IL-13濃度的比較(pg/mL,±s)

與C 組相比:＊P<0.05;與A 組相比:P<0.05。

組別 n BALF中IL-13濃C組 8 28.6±9.2 A 組 8 147.4±56.3＊K1組 8 102.5±34.9K2組 8 96.4±27.2K3組 8 99.6±30.7

3 討 論

哮喘的發病機制復雜,至今未能完全明確,已有的研究傾向于哮喘是一種由多種細胞(如嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞、肥大細胞、氣道上皮細胞)及細胞組分參與的慢性非特異性氣道炎癥,氣道炎癥、氣道高反應性(AHR)與氣道重構是哮喘的重要病理變化[4]。氣道炎癥的形成和持續存在,引起了支氣管收縮、血漿外滲、黏液分泌、神經系統的激活和氣道高反應性,同時還刺激成纖維細胞和平滑肌細胞的增殖,造成管壁增厚,管腔狹窄,產生持續性的氣道高反應性和不可逆性氣流阻塞,使哮喘慢性化、頑固化甚至肺功能下降。細胞因子已經證實通過直接與選擇性募集和激活炎癥細胞在氣道中發揮破壞作用而導致炎癥發生,白細胞介素-13(IL-13)是近年來最受重視的Th2細胞因子,是由活化的肥大細胞、Th2型細胞和自然殺傷細胞分泌,和IL-4具有高度的同源性。在氣道平滑肌和杯狀細胞的表面存在大量的IL-13受體,IL-13與其受體結合后表現為氣道的反應性增高、黏液分泌增多、平滑肌細胞的增生肥大及結構的改變(氣道重建),同時分泌嗜酸性細胞趨化因子,促進了嗜酸性細胞向病變部位聚集,使氣道炎癥加重。文獻報道[5]IL-13對哮喘及過敏性氣道炎癥的發生發展起重要作用,它是引起氣道炎癥反應,杯狀細胞增生,氣道高反應性及上皮下纖維化的始動因子。

氣道高反應性是支氣管哮喘公認的基本特征之一,也是哮喘發生發展的重要因素,AHR和哮喘的嚴重程度呈正相關,能否降低AHR是治療效果的重要指標[6]。目前AHR發生的確切機制尚不明確,但是氣道炎癥是引起AHR的重要原因的理論已受到人們的重視,有研究認為IL-4、IL-13在AHR的發生中起關鍵作用[7-8],本實驗中也顯示哮喘組大鼠IL-13相比對照組升高。

氯胺酮可以通過抑制副交感神經的活性而擴張氣道,被推薦用于支氣管哮喘患者的麻醉[9-10];Allen等[11]研究發現氯胺酮可以防止重癥哮喘的惡化,改善哮喘患者的肺功能,在臨床上常用于治療重癥和持續狀態的哮喘;離體實驗中氯胺酮具有直接舒張支氣管平滑肌的作用,Brown等[12]在研究中發現,臨床使用濃度的氯胺酮能明顯抑制電場刺激迷走神經引起的氣道阻力。氯胺酮具有明顯的抗炎作用,氯胺酮具有抑制活化的中性粒細胞的功能,它可抑制中性粒細胞在趨化因子的作用下穿透內皮細胞的活動;Kawasaki等[13]研究發現,在脂多糖活化的人全血細胞中應用氯胺酮,可明顯抑制TNF-α、IL-6、IL-8的產生。Yu等[14]研究認為,靜脈應用氯胺酮可以抑制脂多糖誘導的外周血單核細胞NF-к B的活化和TNF-α的產生,氯胺酮局部應用可產生抑制炎癥細胞的黏附、減少白蛋白的外滲等抗炎效應。霧化吸入療法具有獨特的藥動學原理和良好的藥效學表現,是目前哮喘治療的最佳途徑之一。

本研究結果顯示氯胺酮霧化吸入治療可明顯降低哮喘大鼠肺泡灌洗液中總細胞數、嗜酸細胞和淋巴細胞數,降低IL-13的濃度,說明其可以減輕哮喘大鼠的氣道炎癥,同時其也能降低哮喘大鼠ACH激發后的氣道阻力,降低氣道反應性,改善哮喘癥狀,為臨床治療哮喘尤其是難治性哮喘提供一個很好的思路。

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