18-α甘草酸對大鼠四氯化碳慢性肝損傷的治療作用

徐中南,吳錫銘,王 佩,張喜全,夏春光,戴 峻,朱 玲,李 琨,曲 穎,徐銘益,陸倫根

(1.上海交通大學附屬第一人民醫院消化科,上海,200080;2.江蘇正大天晴藥業股份有限公司,江蘇南京,210018;3.浙江省杭州市第六人民醫院,浙江 杭州,310014)

許多研究表明甘草酸制劑具有較強的抗病毒、保護肝細胞、降低丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸轉移酶(AST)以及血清膽紅素水平的作用。近來的研究顯示它還具有明顯的抗纖維化、抗氧化和抗細胞凋亡等功效[1]。因此在臨床上被廣泛應用于治療多種原因所致的肝臟疾病。本文我們進一步觀察了18-α甘草酸對大鼠四氯化碳慢性肝損傷的治療作用,為臨床應用提供更多的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

取18-α甘草酸(18α-glycyrrhetinic acid,18-α-GA,批號:20010306,江蘇正大天晴藥業股份有限公司),用0.9%氯化鈉溶液分別制成每1 mL含2.5、5、10 mg的溶液,pH 為6.5～8.0,用4#垂熔漏斗過濾,灌裝于10 mL安瓿中,熔封,105℃滅菌45 min。臨用前用滅菌生理鹽水稀釋或直接應用。取四氯化碳(上海化學試劑公司)25 g,加入橄欖油(上海化學試劑公司)中溶解,加橄欖油至100 mL(W/V),將四氯化碳橄欖油溶液超聲15 min。

1.2 實驗動物

雄性SD大鼠110只,(160±10)g,清潔級(浙江省醫學實驗動物中心,合格證號:浙醫實動單項準第2001001號)。實驗期間所有動物除中毒后絕食20 h(自由飲水)外,其余時間均自由進食和飲水。

1.3 方法

將110只SD大鼠隨機分為6組,正常對照組10只,其他5組每組20只。除陰性對照組外,其余所有動物均皮下注射25%CCl4橄欖油液2 mL/kg,每周2次,連續13周。藥物治療組于注射CCl4后第5周起分別腹腔注射18-α-GA 15、30、60 mg/kg(根據小鼠靜脈注射18-α-GA LD50=586 mg/kg及預試驗選擇的治療劑量約為LD50的1/10,1/20,1/40),陰性對照組和模型對照組腹腔注射同容積滅菌生理鹽水,陽性對照組腹腔注射復方甘草酸[Stronger Neo Minophagen C,SNMC;深圳健安醫藥公司,批號:02119,中國藥品注冊證編號:X960546-(2);由0.2%甘草酸、0.1%半胱氨酸、2%甘氨酸組成,每1 mL相當甘草酸(甘草酸單銨)2 mg]SNMC 30 mL/kg,每日 1次,連續至第 13周,于末次給藥 24 h后,處死動物,取血分離血清或血漿,測ALT、AST、總蛋白、白蛋白、球蛋白、A/G 比例、唾液酸、一氧化氮及透明質酸。每只動物取肝左葉兩份,一份經液氮保存測定羥脯氨酸含量,另一份作病理切片,蘇木精-伊紅(HE)染色和銀染法分別觀察肝組織的炎癥和纖維化的程度,病理組織學判斷標準按Scheuor[2]推薦的方法,進行計數等級分析。實驗結束后,實驗動物死亡數在模型對照組、陽性對照組和低劑量治療組均為10只,中劑量治療組為11只,高劑量治療組為9只。

2 結 果

2.1 18-α-GA對CCl4引起慢性肝損傷大鼠

血清ALT和AST的改變

取各組存活大鼠血清,用Hitachi 7060型全自動生化分析儀測定ALT和AST的活力,結果各組存活大鼠血清轉氨酶水平均明顯升高,模型對照組ALT增高幅度約為正常對照組的59倍,各治療組均低于此水平,并呈劑量依賴(表1)。

表1 18α甘草酸對CCl4引起慢性肝損害大鼠肝功能的影響

2.2 18-α-GA對CCl4引起慢性肝損傷大鼠血清蛋白的影響

各組存活大鼠血清經Hitachi 7060全自動生化分析儀測定總蛋白、白蛋白含量,A/G比例,結果各組白蛋白含量和A/G比例均明顯低于正常對照組,治療組血清白蛋白略高于模型對照組,差異有統計學意義,而總蛋白明顯高于模型對照組,但A/G比例無明顯提高,說明各組試驗動物均明顯存在肝組織間質炎癥,治療組肝臟實質損害程度比模型對照組輕,且代償功能良好(表2)。

表2 18α-GA對CCl4慢性肝損傷大鼠血清蛋白的影響作用

2.3 18-α-GA對CCl4慢性肝損傷大鼠肝組織羥脯氨酸的影響

取各組經液氮貯存的肝組織稱重(濕重),用蒸餾水制成10%的肝勻漿,按文獻方法[3]測定羥脯氨酸含量,結果各組肝組織羥脯氨酸均有不同程度增加,其中模型對照組增加幅度為正常對照組的6倍,說明大鼠肝組織膠原合成處于增高水平,各治療組羥脯氨酸含量低于模型對照組,并呈劑量依賴(圖1)。

圖1 各試驗組大鼠肝組織羥脯氨酸含量(μ mol/g肝重)

2.4 18-α-GA對CCl4慢性肝損傷大鼠血清唾液酸的影響

取各組存活大鼠血清用硫代巴比妥法測定唾液酸(Sialic acid,NANA)含量[4],結果各組動物血清NANA含量均有明顯增高,說明慢性肝損傷會影響肝組織對NANA的結合,使血清NANA含量升高,治療組能提高肝細胞對NANA的結合能力,抑制血清NANA水平,并呈劑量依賴(圖2)。

圖2 各試驗組大鼠血清唾液酸含量(μ mol/L)

2.5 18-α-GA對CCl4慢性肝損傷大鼠血清透明質酸的影響

取各試驗組大鼠血清用放免法檢測血清透明質酸(HA)的含量,試劑盒購自上海海醫所,結果各試驗組血清HA含量均明顯高于正常組,模型對照組增高幅度為正常值的2倍,治療組增高值低于模型對照組水平(圖3)。

圖3 各試驗組大鼠血清透明質酸含量(ng/mL)

2.6 18-α-GA對CCl4慢性肝損傷大鼠血漿一氧化氮的影響

取各試驗組存活大鼠血漿采用熒光分光光度法[5]測定一氧化氮(NO)濃度。根據一氧化氮與巰基化合物反應生成亞硝基硫醇,產生可測量的光學信號,并利用熒光物質的原級內濾效應(Inner filter effect)提高靈敏度,于島津 RF-5301PC熒光分光光度計中測定熒光強度,按工作曲線計算NO濃度,結果各組慢性肝損傷大鼠血清NO濃度顯著高于正常對照組,藥物治療組與模型對照組比較,差異均有統計學意義(圖4)。

圖4 各試驗組大鼠血漿NO含量(μ mol/L)

2.7 18-α-GA對CCl4慢性肝損傷大鼠肝組織病理改變的影響

各試驗組存活大鼠肝臟病理切片光學顯微鏡觀察表明,模型對照組多數大鼠肝組織學改變為小葉內橋型壞死范圍廣并累及多個小葉呈多小葉壞死,纖維分隔形成伴小葉結構紊亂,形成早期肝硬化或肝硬化,70%大鼠出現嚴重皮脂囊腫;藥物治療組病理改變多為小葉內肝細胞變性、嚴重壞死,少數伴有橋型壞死(BN),部分大鼠肝組織匯管區周圍輕度碎屑壞死(PN),小葉內肝細胞變性,點、灶狀壞死,并可見嗜酸小體,匯管區周圍纖維化,纖維分隔形成,但小葉結構保留,部分大鼠肝組織為分隔伴小葉結構紊亂,而無肝硬化,未見皮脂囊腫。

3 討 論

作者前期完成的實驗結果顯示18-α-GA具有抑制肝星狀細胞、促進肝細胞增殖的作用,在Fe-NTA誘導氧應激中它還具有抗脂質過氧化的作用,對肝臟細胞的損傷具有保護作用[6-7]。在此基礎上,作者在動物水平進一步觀察18-α-GA對大鼠四氯化碳慢性肝損傷的治療作用。

以CCl4引起的慢性肝炎具有肝細胞壞死、炎癥及纖維化的病理特征。本研究結果顯示,18-α-GA可使肝組織學改變明顯減輕,生化學上則反映為ALT和AST活力降低,血清總蛋白、白蛋白含量升高,表明18-α-GA對肝細胞有很好的保護作用。很多研究證實甘草酸制劑包括18-α-GA具有較強的糖皮質激素作用[8],糖皮質激素可以直接降低脯氨酰羥化酶的活力,抑制膠原的合成。因而推測,18-α-GA降低肝組織羥脯氨酸含量可能與以上作用有關。唾液酸是酸性糖與神經酰胺相連的寡糖,在體內與蛋白質形成糖蛋白,肝細胞膜上具有識別去唾液酸血漿蛋白、加強血漿蛋白分解的受體,肝硬化會影響肝細胞對去唾液酸糖蛋白的結合作用,后者與肝功能和肝纖維化有關。透明質酸是反映肝細胞功能及肝纖維化進程的實用指標,其升高幅度與肝纖維化改變成正相關。模型對照組大鼠血清唾液酸、透明質酸含量都明顯升高,而18-α-GA均能抑制血清唾液酸及透明質酸,也反映18-α-GA具有改善肝功能,減輕肝纖維化的作用。CCl4引起的慢性肝炎為慢性氧化性肝損傷,其活性氧中間體被認為是重要致病因素,而內源性NO可與超氧陰離子等自由基反應生成低毒物質,對氧化性肝損傷具有保護作用,但同時NO與活性氧中間體反應可生成高毒性物質,而加重氧化性肝損傷。近年研究提示內源性NO可能介導肝硬化高動力循環,使血漿NO水平增高[9]。本試驗模型對照組大鼠血清NO水平則明顯增高,18-α-GA能降低NO水平,并呈劑量依賴,由于NO在肝內的作用與影響較復雜,具體機制尚需進一步闡明。此外,在本實驗中發現模型對照組大鼠普遍出現嚴重皮脂囊腫,18-α-GA治療組大鼠無一例出現皮脂囊腫,這些結果提示可能與18-α-GA的抗炎作用有關,具體機制有待進一步研究。

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