脂肪組織來源干細胞的分離培養及鑒定

傅榮，游曉波，魯峰

(1.四川省醫學院科學院·四川省人民醫院整形外科，四川 成都 610072;2.南方醫科大學南方醫院整形外科，廣東 廣州 510515)

種子細胞的獲取、培養與種植是組織工程學的關鍵性步驟，是其前提和基礎。一段時間以來，種子細胞來源不足、體外擴增能力弱、細胞數量有限和功能老化等問題限制了組織工程技術的發展與應用。解決種子細胞問題的關鍵就是如何獲得來源廣泛、數量充足、功能良好的細胞［1～3］。目前，干細胞作為種子細胞，因其具有強大的自我更新、多向分化或跨胚層發育的可塑，在組織工程的構建及基因的治療方面具有巨大發展潛力。而干細胞中的成體干細胞在應用上與胚胎干細胞相比，不存在一些倫理學問題，取材方便，對機體無害，由于誘導的組織不存在配型及免疫排斥問題且分化的組織類型廣泛，具有重要的臨床價值［4～6］。近年來的研究證實，脂肪組織中能分離和培養出脂肪組織來源干細胞(adiposederived stem cells，ASCs)，可以向成軟骨細胞、成骨細胞、肌細胞、神經細胞和脂肪細胞等不同胚層來源的細胞分化，具備自我更新能力與多向分化潛能，類似于骨髓間充質干細胞等特性［7～9］，具有能大量獲得、自體取材容易、來源廣泛的優勢，是一種較理想的組織工程種子細胞。脂肪組織一般通過脂肪吸脂術獲取，而抽吸物中包含脂質和液體兩部分［10］，脂質部分已被證實可以分離出具有多向分化能力的干細胞，而液態部分中是否也包含類似的干細胞。我們已證實液態部分含有ASCs，并在細胞的生長動力學、形態學、細胞衰老、表面標志物和分化能力等方面與脂質部分的干細胞具有非常相似的特性，認為這種經過最小限度人工干預的ASCs可能是將來脂肪組織工程比較理想的種子細胞［6］。2010年1～12月四川省醫學院科學院·四川省人民醫院整形外科將脂肪抽吸術中獲得的脂質成分作為脂肪干細胞的來源，進行分離、培養、分化和鑒定等，為尋找一種理想的組織工程種子細胞提供實驗依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器 胎牛血清(PAA)高糖的DMEM、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰蛋白酶-EDTA、青鏈霉素原液，I型膠原酶(Sigma)，地塞米松(Sigma)，胰島素(Wako)，吲哚美辛(Sigma)，IBMX(Sigma)，油紅“O”，細胞培養瓶、培養板、培養皿，CD105、CD34、SMA和Ⅷ因子單克隆抗體(Zymed)，細胞免疫化學SPK檢測試劑盒(Zymed)，CO2細胞培養孵箱(Forma)，超凈工作臺，低溫高速離心機，倒置顯微鏡，流式細胞儀。

1.2 組織材料 脂肪來自4例18～40歲行腹部及大腿脂肪抽脂術的健康成人，供體無傳染病及內分泌疾病，男女比例為1∶1，平均脂肪抽吸物100 ml。

1.3 實驗方法

1.3.1 人ASCs的體外分離培養及生物學特性分析①脂肪組織采集及ASCs的分離:脂肪抽吸物被分為兩種成分:一種是比重小的脂質成分，另一種是比重大的液體成分。本實驗采集液體成分作為ASCs的來源。取得液體成分約300 ml，經400 r/min低速離心5分鐘，去上清，取沉淀加入適量完全培養基制成混懸液，沉淀混懸后100 μm尼龍網過濾，細胞懸液用細胞記數板記數。②原代培養:ASCs懸液接種于75 cm2培養瓶內(5×104)，37℃，5%CO2培養箱內培養，24小時、72小時各換液一次，去除非貼壁細胞，貼壁培養純化ASCs，每3天換液一次。③ASCs傳代培養:至細胞生長至80%融合時，0.05%胰酶/0.02%EDTA消化傳代，10%FBS DMEM培養液中止細胞消化，400r離心5～10分鐘，10%FBS DMEM培養液重懸細胞，將細胞懸液接種于三個75 cm2培養瓶內37℃，5%CO2培養箱內培養。④ASCs活力測定:取50 μl細胞重懸液與50 μl的0.2%臺盼藍染液混合，于血球計數板上計數四個大方格內的細胞總數、死細胞數，計算活細胞的百分率［活細胞百分率=(活細胞數/總細胞數)×100%］。⑤ASCs的生長及增殖特點:細胞培養過種中每日在相差顯微鏡下觀察細胞形態變化及生長增殖狀況并拍照。采用離心法獲取ASCs，傳2代后，獲得均一的成纖維樣細胞，0.25%胰酶+0.02%EDTA消化，制成細胞懸液，接種至24孔培養板中(1×104細胞/孔)，每日取4孔細胞胰酶消化進行細胞計數，剩余細胞，每3天換液1次，根據計數結果求平均數以繪制ASCs細胞生長曲線。

1.3.2 流式細胞儀檢測體外培養細胞的分子表達四代細胞培養達90%融合后，徹底清洗去除懸浮細胞后，胰酶消化，PBS重懸，每組取細胞2×106，行流式細胞儀檢測，分別檢測顯示ASCs特異性的CD44、CD29、CD106、CD34;成纖維細胞特異性的 HLA-DR;造血干細胞標志的CD133、CD45進行檢測的百分比。設空白對照(不加一抗和對應二抗)和陰性對照(不加一抗，只加入二抗)。具體步驟:每組取培養細胞1×106，50%乙醇透化處理30分鐘，4℃ 1500 rpm離心10分鐘，棄上清，PBS洗滌，離心(同上)后制成100 μl單細胞懸液，各組分別加入鼠抗人 CD34、CD44、CD29、HLA-DR、CD133、CD106、CD45，室溫孵育 30 分鐘，PBS洗滌，離心，加入FITC標一記的羊抗鼠二抗(1∶100)，4 ℃避光孵育30分鐘，PBS洗滌，離心，加PBS 至300 μl，制成細胞懸液，FCM 分析。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察 把抽吸物液體部分直接離心、過濾，不經過酶消化，在接種48小時內ASCs是由大量圓形、透亮、無核的紅細胞所覆蓋，未見有梭形細胞貼壁。因為紅細胞為懸浮細胞，不貼壁的紅細胞在更換培養基時可除去。故經過2～3次換液后，紅細胞逐漸減少直至最終消失，取而代之的是大量貼壁的梭形細胞(圖1a)。貼壁的細胞成纖維細胞樣的形態，在最初的5～7天有一段生長延滯時間。然后細胞進入增殖期，此后細胞增殖旺盛，原代培養的細胞8～12天即達70%～80%融合。單層細胞以0.25%胰蛋白酶消化傳代，以后每2～3天傳代一次。傳代后細胞形態主要為梭形(圖1b)，體外傳至10代后，細胞形態及倍增時間無明顯改變。

2.2 細胞活性 ASCs在倒置顯微鏡下觀察，均生長良好，細胞透光性好，形態完整，細胞碎片少，細胞穩定性好，可連續傳代。細胞臺盼藍染色，活細胞不被染色，死細胞被染成藍色，鏡下觀察，被染成藍色的細胞很少(圖 1c)。各組細胞在第 1、3、5、7、9 和11天的細胞存活率分別為(92.29±0.91)%、(92.83±1.26)%、(91.99±0.83)%、(92.93±0.81)%、(92.02±0.92)%和(91.98±0.93)%。

2.3 體外培養ASCs增殖速度 原代貼壁培養的ASCs生長速度緩慢，細胞密度不均，培養約10～12天后細胞才能達到90%融合。傳代培養后，細胞形態及密度均勻，數小時內貼壁并伸展成多角形、梭形。2天前為相對抑制期，此后呈指數形式快速增殖，3～5天后達到80% ～90%融合。根據不同培養時間細胞數量繪制ASCs生長曲線。

2.4 流式細胞儀鑒定 流式細胞儀測得ASCs表面標記CD29、CD44陽性表達，說明該細胞具有干細胞特性;HLA-DR幾乎無表達，排除該類細胞是成纖維細胞。ASCs細胞表面抗原分析:CD2974.0%，CD4436.9%，CD341.4%，HLA-DR 1.8%。

圖1 人脂肪組織來源干細胞ASCs的分離培養，熒光標記及多向分化 a：原代培養的ASCs b:熒光顯微鏡下GFP標記的ASCs c：ASCs的體外成脂，成骨，成軟骨分化及鑒定

3 討論

隨著現代醫學的發展，人們已成功分離培養了多種干細胞，這為人類探索干細胞生物學調控機理和評價其治療人類許多疾病的潛能打開了方便之門。干細胞總體上可分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞在理論上雖具有最理想的效果，但其自身的免疫原性、取材困難以及宗教倫理道德等問題，限制了它在臨床上的應用。而成體干細胞在分化能力上不及胚胎干細胞，但由于其可避免社會倫理之爭，逐漸成為研究的熱點。研究已證實從骨髓中分離得到的成體干細胞，在體外條件下可大量擴增并表現出廣泛的多向分化潛能［11，12］。鑒于脂肪組織與骨髓同屬于中胚層組織，因此有學者認為脂肪組織中也應該含有類似的干細胞，該假設被隨后一系列的實驗所證實。

近年來，多個研究小組從脂肪組織中分離得到的抽脂處理細胞［13］、脂肪基質微管碎片細胞、脂肪組織源基質細胞、脂肪源中胚層干細胞、或者脂肪源間質干細胞、脂肪源成體干細胞等［14～18］，這些細胞可能就是脂肪組織中的一類多能性干細胞，因為它們均表現出具有體外可大量擴增和多向分化的能力。目前，各國研究人員大多采用這種方法來分離和培養此種細胞并將所得的細胞稱之為 ASCs［19，20］。

目前已證實ASCs能向脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、肌肉細胞及心肌細胞定向誘導轉化，可作為多種組織工程的種子細胞。另外，ASCs目前已被用于研究骨缺陷、直腸陰道瘺的治療和軟組織增高術的臨床實驗。由于ASCs具有易獲得性、可迅速擴增及多向分化潛能等特點，其將成為具有廣闊治療應用前景的一類成體干細胞。

我們采用簡便經濟方法，在未消化干細胞的條件下，從液體成分中成功獲得ASCs，效率較高，避免了紅細胞裂解液對細胞的損傷，同時避免了密度梯度離心法的操作復雜性。這種方法分離和培養出的細胞具有很強的增殖活性，體外培養可以保持在穩定的群體倍增數增長階段，且傳至10代以上增殖速度無明顯變化。可以推測，經過最小限度人工干預的ASCs，其安全性和有效性將會更高，將更適合作為構建組織工程脂肪的種子細胞來源。

［1］Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et al.Multilineage cells from human adipose tissue:implications for cell-based therapies［J］.Tissue Eng，2001，7:221-228.

［2］Ferrara N.Molecular and biological properties of vascular endothelial growth factor［J］.J Mol Med，1999，77:527-543.

［3］Frerich B，Lindermann N，Krutz-Hoffman J，et al.In vivo model of a vascular stroma for the engineering of vascularized tissues［J］.Int J Oral Maxillofacial Surg，2001，30(5):414-420.

［4］Cho SW，Kim SS，Rhie JW，et al.Engineering of volume-stable adipose tissues［J］.Biomaterials，2005，26(17):3577-3585.

［5］Shieh SJ，Vacanti JP.State-of-the-art tissue engineering:from tissue engineering to organ building［J］.Surgery，2005，137(1):1.

［6］魯峰，高建華，水野博司，等.脂肪組織來源干細胞定向分化脂肪組織的體內外實驗研究［J］.中華整形外科雜志，2007，23(5):412.

［7］Gazit D，Turgeman G，Kelley P，et a1.Engineered pluripoten mesenchymal cells in integrate and differentiate in regenerating bone:a novel cell mediated gene therapy［J］.J Gene Med，1999，1(2):121-133.

［8］Yarlagadda PK，Chandrasekharan M，Shyan JY.Recent advances and current developments in tissue scaffolding［J］.Biomed Mater Eng，2005，15(3):159.

［9］Koide M，Osaki K.A new type of biomaterial for artificial skin dehydrothemally cross-linked composites for fibrillar and denatured collagens［J］.Biomed Mater Res，1993，27:79-87.

［10］Ponticiello MS，Schinagl RM，Kadiyala S，et al.Gelatin-based resorbable sponge as a carrier matrix for human mesenchymal stern cells in cartilage regeneration therapy［J］.Biom Mater Res，2000，52(2):246-255.

［11］Rakesh KJ.Molecular regulation of vessel maturation［J］.Nature Medicine，2003，9:685-693.

［12］馬勇江，屈雷，楊學義，等.脂肪間質干細胞研究進展［J］.生命科學研究，2003，7(4):1-4.

［13］Zuk PA，Zhu M，Ashjian P，et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells［J］.Mol Cell Biol，2002，13:4279-4295.

［14］Ugarte DA，De Alfonso Z，Zuk PA，et al.Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow［J］.Immunol Let，2003，31:267-270.

［15］Yoshimura K，Shigeura T，Matsumoto D，et al.Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates［J］.J Cell Physiol，2006，208(1):64-76.

［16］Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells［J］.Science，1999，284(5411):143-147.

［17］Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et al.Multilineage cells from human adipose tissue:implications for cell-based therapies［J］.Tissue Engineering，2001，7:211-228.

［18］Gronthos S，Franklin DM，Leddy HA，et al.Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells［J］.Journal of Cellular Physiology，2001，189:54-63.

［19］Garcia-Olmo D，Garcia-Arranz M，Herreros D，et al.A phase I clinical trial of the treatment of Crohn's fistula by adipose mesenchymal stem cell transplantation［J］.Dis Colon Rectum，2005，48:1416-1423.

［20］Yoshimura K，Shigeura T，Matsumoto D，et al.Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates［J］.J Cell Physiol，2006，208(1):64-76.