靶向MRP1基因的shRNA穩定逆轉肺癌的多藥耐藥性*

邵淑麗，崔婷婷，賈紅雙，謝振麗，張偉偉，劉 遷，陳薇薇，李 爽，陳 麗

(齊齊哈爾大學生命科學與農林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

化療是肺癌的主要治療手段之一，而多藥耐藥是導致肺癌治療失敗的主要原因［1－2］。多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物出現耐藥的同時，對其它結構不同、作用靶位不同的抗腫瘤藥物也產生抗藥性的現象［3］。腫瘤多藥耐藥的機制復雜，其中主要涉及細胞外排藥物的調控機制。已知相關的轉運體(transporter)屬ABC(ATP－binding cassette)轉運蛋白超家族，ABC轉運蛋白超家族是人類最大的轉運蛋白基因家族，編碼產物是一組跨膜蛋白，即ABC轉運蛋白。其超家族又分為7個亞家族(ABCA、ABCB、ABCC、ABCD、ABCE、ABCF、ABCG)，包括 49 個基因。其中參與腫瘤多藥耐藥的主要成員有ABCB1編碼的P－糖蛋白、ABCC1編碼的多藥耐藥相關蛋白、ABCG2編碼的乳腺癌耐藥蛋白。與腫瘤多藥耐藥相關的主要基因有位于第7號染色體的q21.1區的多藥耐藥蛋白1(multidrug resisitance protein 1，MDR1)基因、位于染色體16q13.1上的多藥耐藥相關蛋白1(multidrug resistance－associated protein，MRP1)基因，和位于人染色體4q22上的乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistence protein，BCRP)基因。肺癌多藥耐藥主要由MRP1基因介導，藥物通過谷胱甘肽S轉移酶和谷胱甘肽(GSH)結合，由 MRP1轉運出胞外［4］。MRP1基因表達增高可導致多藥耐藥的產生，其編碼產物為多藥耐藥相關蛋白，分子量為190 kD，屬于跨膜轉運蛋白。RNA干擾(RNA interference)作為一種新的特異性封閉目的基因表達的方法，已成功用于腫瘤基因功能和基因治療的研究。為了穩定、持久地逆轉肺癌細胞的多藥耐藥性，本研究采用MRP1 shRNA表達質粒載體轉染A549/DDP肺癌多藥耐藥細胞，經G418篩選，有限稀釋法挑取單克隆得到陽性單克隆細胞，探討表達MRP1 shRNA陽性單克隆細胞與親本A549/DDP多藥耐藥細胞在多藥耐藥方面的變化。

材料和方法

1 材料

pSilencer 2.1－U6 neo質粒(北京鼎國生物技術有限責任公司周衛東老師惠贈)，敏感的和耐順鉑的肺癌細胞株A549和A549/DDP(北京腫瘤生物學檢測中心)，RPMI－1640培養基和胎牛血清(上海生工)，ECM830型電穿孔儀(BTX)，熒光定量RCP儀(Bio－Rad)，流式細胞儀(Beckman)，LSM710 激光共聚焦顯微鏡(Zeiss)。

2 方法

2.1 MRP1基因 shRNA表達載體的構建 根據GenBank MRP蛋白編碼基因MRP1 cDNA的已知序列(GeneID:4363)，選擇2個shRNA特異性靶位點序列。設計合成MRP1基因編碼shRNA的DNA模板，將其定向克隆到pSilencer 2.1－U6 neo載體上，2個shRNA表達質粒分別命名為pSilencer 2.1－U6 neo MRP1－2.1－1(1214～1234)和 pSilencer 2.1－U6 neo MRP1－2.1－2(1717～1737)。連接產物轉化，提取質粒，測序鑒定。

2.2 細胞的培養及轉染 細胞均用含0%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI－1640培養液于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。為了維持A549/DDP細胞株的耐藥亞型，培養液中加1.0 mg/L的順鉑。實驗前2周換用無順鉑的培養液。取對數生長期的A549/DDP細胞 ，通過pEGFP－N1質粒優化電轉染條件，線性化的重組質粒于最佳電轉染條件下電轉染A549/DDP細胞，用700 mg/L G418篩選而建立穩定表達 siRNA的A549/DDP細胞克隆。有限稀釋法挑取單克隆轉染細胞分別得到轉染單克隆細胞A549/DDP/sh－2.1－1－1和A549/DDP/sh－2.1－2－1。

2.3 實時熒光定量PCR檢測MRP1 mRNA 采用UNIQ－10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(Sangon)提取細胞總RNA。MRP1正義鏈5'－CGCTGAGTTCCTGCGTACC－3'，反義鏈 5'－TCTGCGGTGCTGTTGTGG－3'，擴增產物為213 bp。以β－actin為內參照，正義鏈5'－TGACGTGGACATCCGCAAAG －3'，反義鏈 5'－CTGGAAGGTGGACAGCGAGG－3'，擴增產物為 205 bp。實時熒光定量PCR擴增條件:94℃ 4 min，94℃20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環 35 次，72 ℃ 檢測信號，循環結束后進行熔解曲線檢測。實驗重復3次，數據以 2－ΔΔCt法進行計算。

2.4 免疫熒光檢測MRP1蛋白的表達 4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖溶液固定實驗組細胞15～20 min，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗2次，加入鼠抗人MRP1單克隆抗體50 μL，室溫孵育1 h，PBS洗1次，洗掉未結合的Ⅰ抗。加入熒光標記Ⅱ抗50 μL，避光室溫孵育1 h，PBS洗去未結合的熒光Ⅱ抗，碘化丙啶(PI)染色封片，激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察，實驗重復3次。

2.5 轉染后細胞內羅丹明 123(rhodamine 123，Rho123)的潴留量 Rho123是MRP1蛋白的作用底物，當細胞的 MRP1合成減少時，其外排功能降低，Rho123在細胞內的潴留量增加。轉染shRNA表達質粒的細胞和對照組細胞分別與0.25 mg/L Rho12337℃孵育1 h，用預冷的 PBS洗3次，以1×109cells/L重懸于預冷的PBS中。流式細胞儀測細胞Rho123熒光強度。

2.6 MTT法檢測耐藥逆轉效果 細胞中分別加入終濃度為 5、10、20、40、80、160、320 μmol/L 順鉑或5 － 氟尿嘧啶，常規四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)于570 nm下測吸光度值(A)。計算細胞存活率=A實驗組/A對照組×100%，以藥物濃度為橫軸、細胞存活率為縱軸繪制濃度效應曲線，求出回歸方程，確定半數抑制濃度(IC50)并計算相對逆轉率，實驗結果重復3次。

3 統計學處理

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據處理，行單因素方差分析(One－way ANOVA)，組間比較用LSD法，數據以均數±標準差()表示。

結 果

1 MRP1基因shRNA表達載體的鑒定

經測序結果鑒定，重組質粒的堿基序列與預期結果一致，重組質粒構建成功。

2 pEGFP－N1質粒優化電轉染條件

電轉染時間定為30 ms，分別調節電壓為140 V、160 V、180 V、200 V、220 V、240 V 進行電轉染條件的摸索。結果顯示，電壓為180 V時，細胞存活率在40% ～50%之間，有約80%的細胞發綠色熒光，見圖1。因此，確定脈沖時間30 ms、電壓180 V為電轉染A549/DDP細胞的最佳條件。

Figure 1.The expression of green fluorescent protein in A549/DDP cells transfected with pEGFP－N1 plasmid for 48 h(×200).圖1 pEGFP－N1質粒轉染A549/DDP細胞48 h后綠色熒光蛋白的表達情況

3 熒光定量PCR檢測MRP1 mRNA的表達

應用定量PCR儀自帶數據分析軟件獲得Ct計算出各組細胞MRP－1 mRNA表達值，計算各實驗組細胞MRP1/β－actin的值。結果表明，重組質粒pSilencer 2.1－U6 neo MRP1－2.1－1－1和pSilencer 2.1－U6 neo MRP1－2.1－2－1可以顯著降低A549/DDP細胞內MRP1 mRNA的表達，單克隆細胞A549/DDP/sh－2.1－1－1和A549/DDP/sh－2.1－2－1的MRP1 mRNA/β－actin mRNA比值明顯降低，見圖2。

4 免疫熒光檢測MRP1蛋白表達水平

應用激光共聚焦圖像分析與免疫熒光技術對A549、A549/DDP及轉染質粒的單克隆細胞MRP1蛋白進行定位定量研究，通過激光共聚焦顯微鏡對各實驗組細胞不同視野下采集熒光強度，各實驗細胞采集20組熒光強度數據，每組實驗重復3次，根據熒光強度數據繪制MRP1蛋白表達變化規律及蛋白表達水平圖。結果表明，轉染質粒的單克隆細胞MRP1蛋白相對表達量明顯降低，MRP1蛋白位于細胞膜上，見圖3。MRP1蛋白表達變化規律及蛋白表達水平見圖4、5。

Figure 2.Exppression of MRP1 mRNA..n=3.*P＜0.05 vs A549/DDP or vector control.圖2 各實驗細胞MRP－1 mRNA表達

Figure 3.Immunofluorescent staining for MRP1 protein expression.Green color represents MRP1 and blue color represents nuclei.Scale bar:10 μm.圖3 免疫熒光檢測實驗細胞中MRP1蛋白表達

Figure 4.The changes of MRP1 protein expression.圖4 MRP1蛋白表達變化規律圖

Figure 5.The expression level of MRP1 protein..n=3.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs A549/DDP or control.圖5 MRP1蛋白表達水平

5 實驗細胞內Rho123潴留量的變化

轉染單克隆細胞A549/DDP/sh－2.1－1－1和A549/DDP/sh－2.1－2－1細胞內熒光強度明顯增加，與耐藥細胞株A549/DDP比較，差異顯著(P＜0.05)，見表 1。

表1 各組細胞Rho123的相對熒光強度Table 1.Accumulation of Rho123 in the cells of different groups(%..n=3)

表1 各組細胞Rho123的相對熒光強度Table 1.Accumulation of Rho123 in the cells of different groups(%..n=3)

*P ＜0.05 vs A549/DDP or vector control.

Group Rho123 retention A549/DDP 16.93 ±0.58 Vector control 18.44 ±0.45 sh－2.1 －1 －1 89.02 ±0.59*sh－2.1 －2 －1 82.56 ±1.37*A549 94.53 ±1.19*

6 多藥耐藥逆轉效果

MTT檢測顯示，與對照組肺癌親本細胞相比，穩定表達陽性單克隆細胞A549/DDP/sh－2.1－1－1和A549/DDP/sh－2.1－2－1抗腫瘤藥的IC50均顯著降低，見表2。

討 論

RNA干擾因其可以高效、特異地抑制靶基因的表達而迅速成為一種非常有效的在真核細胞中研究基因功能的工具，從而提供了基因敲除之外的另一種選擇。RNAi作為沉默基因的新方法已成功地用于腫瘤學的研究，而且siRNAs在極低濃度存在的情況下能特異地封閉mRNA的表達。夏忠勝等［5］應用RNAi技術，設計針對MDR1 mRNA的siRNAs轉入人結腸癌細胞中，結果siRNAs可特異抑制MDR1在mRNA和蛋白質水平表達，抗癌藥物敏感性增強，實驗證實，siRNAs可特異逆轉MDR1介導的耐藥。同樣魏軍民等［6］在乳腺癌細胞MCF－7/ADR的研究中得到相似結果。

表2 A549/DDP親本細胞及其來源的單克隆細胞DDP及5－FU的IC50和相對逆轉率Table 2.The IC50and relative reversal rates of A549/DDP cells treated with siRNA for DDP and 5－FU(.n=3)

表2 A549/DDP親本細胞及其來源的單克隆細胞DDP及5－FU的IC50和相對逆轉率Table 2.The IC50and relative reversal rates of A549/DDP cells treated with siRNA for DDP and 5－FU(.n=3)

＊＊P ＜ 0.01 vs A549/DDP or vector control.

Group DDP(μmol/L) 5－FU(μmol/L) DDP reversal rate(%)5－FU reversal rate(%)A549/DDP 101.45 ±0.64 263.20 ±2.00— —Vector control 96.43 ±3.31 247.57 ±5.72 4.97 ±0.12 5.94 ±0.18 sh －2.1 －1 －1 38.06 ±0.05＊＊ 98.82 ±1.16＊＊ 79.35 ±1.86 78.55 ±0.59 sh －2.1 －2 －1 53.72 ±0.36＊＊ 141.81 ±0.49＊＊ 59.74 ±0.64 57.93 ±1.80 A549 21.56 ±0.44 53.30 ±2.52— —

本研究采用RNA聚合酶III U6啟動子表達siRNA分子，采用此方法表達siRNA分子適合用于進行靶基因的表達受到抑制后細胞表型的長期變化觀察，也適于進行文庫的篩選。此方法克服了人工合成或體外轉錄的siRNA分子價格昂貴、基因沉默時間短、轉染效果不穩定等問題。本實驗根據MRP1基因表達序列設計有效的RNA干擾片段，在體外構建表達并獲得 MRP1基因特異的 shRNA質粒表達載體pSilencer 2.1－U6 neo－MRP1，pSilencer 2.1－U6 neo－MRP1表達載體含有U6啟動子和抗G418基因，能在細胞轉染后用G418進行簡便的篩選。本實驗應用電穿孔轉染將重組表達載體穩定導入A549/DDP細胞內，與其它技術相比更易操作，可以對很廣范圍的動物細胞發揮作用。

pEGFP－N1質粒含有可編碼綠色熒光蛋白基因，轉染細胞后，在細胞內發綠色熒光，通過熒光多少可以判斷轉染效率，采用pEGFP－N1質粒優化電轉染條件，其操作簡單、快速、直觀、準確，可以取得較高的轉染率。本研究用Sac I線性化酶將重組載體線性化后轉染，有利于重組載體整合到宿主細胞的基因組中，提高了穩定轉染的水平。本研究通過G418篩選和有限稀釋法挑取單克隆，得到性能專一的單克隆細胞A549/DDP/sh－2.1－1－1和A549/DDP/sh－2.1－2－1，將所得單克隆投于液氮中，2個月后，經復蘇傳代1個月，實時熒光定量PCR及免疫熒光檢測證實其MRP1 mRNA和蛋白的表達仍被穩定抑制，結果顯示A549/DDP/sh－2.1－1－1和A549/DDP/sh－2.1－2－1與 A549/DDP細胞相比，MRP1 mRNA表達量分別下降到47.89% ±0.00%和55.03% ±0.81%，轉染細胞蛋白表達量分別下降到83.83% ±1.20%和 48.16% ±0.69%。結果說明穩定轉染含編碼MRP1 siRNA的質粒載體能長期穩定抑制549/DDP肺癌多藥耐藥細胞MRP1 mRNA和蛋白的表達。單克隆細胞經過長期的凍存和傳代培養，多藥耐藥逆轉效果仍較好，可見本實驗方法可長期、穩定逆轉A549/DDP的多藥耐藥性，恢復對化療藥物的敏感性。

本研究結果初步證明RNA干擾技術能夠穩定、長期地封閉MRP1基因的表達，也為進一步體內的動物實驗提供了可能性。

［1］Pan GD，Yang JQ，Yan LN，et al.Reversal of multidrug resistance by pSUPER－shRNA－mdr1 in vivo and in vitro［J］.World J Gastroenterol，2009，15(4):431 －440.

［2］Borel F，van Logtenstein R，Koornneef A，et al.In vivo knock－down of multidrug resistance transporters ABCC1 and ABCC2 by AAV－delivered shRNAs and by artificial miRNAs［J］.J RNAi Gene Silencing，2011，7:434 － 442.

［3］譚偉欣，黃永明，劉金文.MRP1介導的多藥耐藥及其逆轉劑的研究進展［J］.廣東醫學，2006，27(9):1418 －1420.

［4］Li J，Li ZN，Du YJ，et al.Expresion of MRP1，BCRP，LRP，and ERCC1 in advanced non－small－cell lung cancer:correlation with response to chemotherapy and survival［J］.Clin Lung Cancer，2009，10(6):414 － 421.

［5］夏忠勝，朱兆華，陳其奎，等.靶向MDRl基因的RNAi穩定逆轉結腸癌細胞的多藥耐藥性［J］.中國病理生理雜志，2009，25(5):898 －903.

［6］魏軍民，侯 明，李麗珍，等.短發夾RNA干擾表達質粒逆轉人乳腺癌細胞MCF－7/ADR多藥耐藥的研究［J］.山東大學學報，2008，46(4):350－352.