納米金抑制Ang－2和RGS－5表達導致裸鼠肝癌血管正常化*

傅岳武，潘運龍△，覃 莉，孫 立，劉英梅

(暨南大學1附屬第一醫院普外科，2醫學院組織學與胚胎學教研室，3醫學院中醫系，廣東 廣州 510632;4中山大學附屬孫逸仙紀念醫院心內科，廣東 廣州 510120)

腫瘤的生長和轉移依賴其新生血管，抗血管生成不僅抑制腫瘤血管生長，而且在治療后特定時間窗內，能修復異常腫瘤血管系統，使其血管正常化。此時血管網絡清晰、管徑均勻、血管無扭曲及紊亂，血管形態和功能趨于正常，腫瘤組織間液壓降低，氧供及血供改善，從而提高放療和化療的敏感性;但抗血管生成治療使腫瘤血管出現正常化的時間窗短暫，且不同的抗血管生成藥物，其腫瘤血管正常化的窗口期也不盡相同，大多集中在5～8 d［1］。納米金是抗血管生成藥，有抗腫瘤血管生成作用［2］，但納米金有無影響腫瘤血管正常化的功能則未見報道。血管生成素(angiopoietin，Ang)及G蛋白信號調節蛋白－5(regulator of G －protein signaling－5，RGS－5)均參與腫瘤組織的血管生成和血管成熟過程，其中Ang－1和Ang－2表達的相對平衡有維持血管穩定性的作用［3］，RGS－5表達的缺失有利于腫瘤血管外壁周細胞表型的成熟。周細胞有覆蓋內皮細胞、包繞血管腔的作用，在新生血管中，成熟的周細胞覆蓋是血管趨向正常化的標志［4］，因此本實驗選用富血管的裸鼠肝癌模型，經納米金處理后，不同時間窗內檢測Ang－1、Ang－2及RGS－5在腫瘤組織中的表達，同時觀察腫瘤血管壁周細胞形態、結構變化，來探討納米金使腫瘤血管正常化的時間窗及可能的機制。

材料和方法

1 動物和試劑

BALB/c裸小鼠(nu/nu)48只，6周齡，體重為15～17 g，SPF級，購自暨南大學實驗動物中心。H22人肝癌細胞株購自中山大學醫學院細胞凍藏中心。鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化酶試劑盒，購自晶美生物技術公司;DAB酶底物濕色試劑盒，購自北京中杉生物技術公司。Ang－1、Ang－2和RGS－5試劑盒均購于Sigma，3種抗體工作濃度均為1∶80。納米金合成原料氯金酸、檸檬酸三鈉、重鉻酸鉀和硫酸均購自上海化學試劑廠。用氯金酸檸檬酸三鈉還原法制備納米金，并作改進，具體方法見文獻［5］。

2 動物模型建立及分組

6周齡BALB/c裸鼠48只，稱重后，分別從裸鼠右腋皮下注入H22細胞，1×106個(0.2 mL)。4 d后，腫瘤在皮下形成約3～4 mm大小結節，隨機分為實驗組和對照組，實驗組36只裸鼠，對照組12只裸鼠。實驗組裸鼠從腫瘤周圍及瘤內注入納米金溶液0.2 mL(濃度為500 nmol/L)，每天1次，連續給藥3 d、7 d及11 d后，以安死術分別處死裸鼠，每次12只。對照組:用生理鹽水替代納米金，處理方法同實驗組。每天稱重并觀察腫瘤生長情況及注射部位皮膚有無潰瘍及感染，處死動物，留取部分新鮮腫瘤組織標本作電鏡觀察，余組織用4%甲醛溶液固定以備作免疫組化染色。另選取大小、體重與實驗組及對照組基本一致的6周齡BALB/c裸鼠2只設為陰性對照組。該組動物正常飼養，無任何藥物注射，實驗結束后安死術處死。取部分正常新鮮肝組織作電鏡觀察，余下組織用4%甲醛溶液固定作免疫組化染色。

3 Ang－1、Ang－2、RGS－5及不成熟周細胞覆蓋率(immature pericyte coverage index，IMPI)檢測

所有標本經4%甲醛固定、常規脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋。4 μm厚連續切片，分別做HE和免疫組化染色。采用鏈酶親和素－生物素過氧化物酶(SP)進行免疫組織化學染色。Ang－1、Ang－2和RGS－5表達陽性者在細胞膜和(或)胞質見清晰棕黃色顆粒沉積為準。在200倍鏡下，每例標本隨機選取5個視野，每個視野觀察100個細胞計數，顯色陽性細胞(清晰棕黃色染色)占總細胞計數≥10%為陽性;否則為陰性。對于陽性率＜10%，不論其染色強度如何均為陰性。對照設置:陽性對照分別選用抗體高表達的組織切片，以PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照。

IMPI定義為RGS－5陽性表達的周細胞數目占總細胞數目的百分數。IMPI計算以連續切片中，高倍視野下RGS－5陽性的細胞數目/總細胞數目×100%。記錄5個不同區域的數據，計算平均數并進行統計分析。

4 電鏡觀察周細胞

取離體30 min內的新鮮腫瘤組織，用含有飽和苦味酸的多聚甲醛液固定5 h。以0.1%PBS液漂洗標本后，20%蔗糖沉淀。50 μm厚振蕩切片機切片，在24孔培養板內備做免疫電鏡。電鏡操作步驟:免疫組化常規染色，并以DAB+氯化鈷加強發色;蒸餾水終止發色，并反復漂洗;鋨酸染色1 h，而后0.1%PBS漂洗;置于50%乙醇和醋酸雙氧鈾混合物內1 h;70%、80%、95%、100%乙醇梯度漂洗;浸入環氧丙烷、環氧丙烷和樹膠(4∶1、2∶1和1∶1)混合物各1 h，而后包埋。在H－600型透射電鏡下觀察拍片。

5 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件分析，數據以均數±標準差()表示，各組間均數比較采用單因素方差分析;計數資料樣本率之間的比較采用卡方檢驗或確切概率(Fisher's exact)法。

結 果

1 納米金對Ang－1和Ang－2表達的影響

Ang－1主要表達于細胞核中，呈棕褐色，見圖1;Ang－2主要表達于胞漿中，呈金黃色，見圖2。結果顯示實驗組裸鼠在第7 d時Ang－1陽性率最高，Ang－2陽性率最低，與對照組及實驗組第3 d、第11 d時陽性率比較，均有顯著差異(P＜0.01或P＜0.05)，見表 1。

Figure 1.Expression of Ang－1 in the H22 hepatic tumor with nanogold treatment(immunohistochemical staining，×200).A:3 d nanogold treatment group;B:7 d nanogold treatment group;C:11 d nanogold treatment group;D:control group.圖1 納米金作用下不同時間窗內Ang－1的表達情況

Figure 2.Expression of Ang－2 in the H22 hepatic tumor with nanogold treatment(immunohistochemical staining，×200).A:3 d nanogold treatment group;B:7 d nanogold treatment group;C:11 d nanogold treatment group;D:control group.圖2 納米金作用下不同時間窗內Ang－2的表達情況

表1 納米金作用下不同時間窗內Ang－1和Ang－2的陽性率比較Table 1.Expression rates of Ang－1 and Ang－2 in H22 hepatic tumor(n=12)

2 納米金對RGS－5表達和IMPI的影響

RGS－5主要表達于細胞漿中，亦呈金黃色，見圖3。結果顯示實驗組裸鼠在第7 d時RGS－5陽性率最低，同時IMPI亦最低，與對照組及實驗組第3 d、第11 d時比較，均顯著差異(P＜0.01或P＜0.05)，見表2、圖4。

3 電鏡下周細胞超微結構觀察

在腫瘤組織中直徑6～40 μm新生血管中，周細胞位于內皮細胞外壁，環繞血管腔。RGS－5表達的周細胞，其胞質中見圓形黑色顆粒，細胞壁薄，細胞形態不規則、大小不一。RGS－5表達缺失的周細胞，其核大、胞質豐碩，電子密度高;微飲泡較少，中間細絲豐富，細胞形態趨于正常和成熟，周圍血管無中斷現象，見圖5、6。

Figure 3.Expression of RGS－5 in the H22 hepatic tumor with nanogold treatment(immunohistochemical staining，×200).A:3 d nanogold treatment group;B:7 d nanogold treatment group;C:11 d nanogold treatment group;D:control group.圖3 納米金作用下不同時間窗內RGS－5的表達

表2 RGS－5在裸鼠肝癌組織中陽性率Table 2.Expression of RGS－5 in H22 hepatic tumor(n=12)

討 論

腫瘤的血管生成過程復雜，涉及多種細胞因子及信號通路。Ang/Tie－2是經血管內皮細胞介導的酪氨酸激酶受體通路，Tie－2的配體是Ang－1和Ang－2。Ang－1是激動劑而Ang－2是拮抗劑，二者共同競爭性作用于內皮細胞膜上特異性受體Tie－2發揮調節血管生長的作用［7］。在正常組織中Ang－1/Ang－2處于一種相對平衡，在腫瘤組織中Ang－2被大量表達，它競爭性抑制Ang－1/Tie－2作用，使內皮細胞外周緊密結構松馳，新生微血管迅速生長，加速腫瘤的侵襲和轉移［8］。

Figure 4.IMPI in different groups..n=12.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;#P ＜0.05 vs 7 d nanogold treatment.圖4 各組間IMPI的比較

Figure 5.Mature pericytes surrounding the normalized vascular walls were found under electronic microscopeed(A，B:×8000;C:10000).A:mature pericytes covered microvascular intima completely.B:the pericyte were of normal shape，uniform size and orderly arrangement.C:organelles were clearly visible in a single pericyte.圖5 電鏡觀察正常化血管的血管壁周細胞

Figure 6.Electronic microscope image of immature pericytes in control group(×10000).A:immature pericytes covered microvascular intima in completely;B，C:the pericytes were of irregular shape，nonuniform size and loose arrangement.圖6 電鏡觀察對照組微血管壁上的不成熟周細胞

本實驗發現納米金處理的裸鼠Ang－1陽性率高于對照組，Ang－2陽性率則低于對照組。用藥7 d的裸鼠，其納米金抑制Ang－2的作用最強。說明納米金能抑制裸鼠肝癌組織分泌Ang－2，調節癌組織中Ang－1與Ang－2的失衡，使Ang－1表達上調、Ang－2表達下調，減少Ang－2競爭性拮抗Ang－1/Tie－2作用，抑制腫瘤血管生成;其最佳時間窗為7 d左右。此時電鏡觀察新生血管外壁的周細胞多數形態均勻、排列整齊，而對照組周細胞大小不一、結合疏松。正如 Jain［1］所述，合理使用抗血管生成藥物，可以重新恢復促血管生成因子和血管生成抑制因子的平衡，使腫瘤血管系統趨于正常。雖然這種動態變化的機理尚未完全闡明，但探討腫瘤血管正常化時間窗可為何時聯合化療或放療提供了策略。Winkler等［9］在研究抗血管生成藥物DC101中發現，藥物能短暫激活Ang－1/Tie－2通路，上調Ang－1表達和下調Ang－2表達，增加成熟周細胞對腫瘤血管覆蓋，使血管直徑下降。此時腫瘤血管變得成熟，更近似于正常血管，與本研究結果一致。這亦說明Ang/Tie－2是調控腫瘤血管正常化的重要細胞信號通路之一。

RGS－5表達于周細胞中，它與血管異常狀態有關。有研究證實，在腫瘤微血管迅速生長過程中，不成熟周細胞覆蓋新生血管苞芽時，RGS－5表達上調;此時周細胞形態異常，與血管壁結合松散、向腫瘤組織內嵌入，對內皮細胞覆蓋、包繞不完整，血管外壁連接不致密，血管腔滲漏性增加，加速腫瘤細胞沿血管壁向周圍組織的侵潤［4］。在RGS－5缺失的胰島素瘤小鼠和野生型胰島素瘤小鼠動物模型中，野生型胰島素瘤小鼠的血管排列紊亂，形成了一個低氧環境，而RGS－5缺失的胰島素瘤小鼠其腫瘤血管特征被顯著改變，血管排列有規則，看上去與正常組織血管類似［10］。本實驗亦發現在納米金處理的裸鼠肝癌組織中RGS－5表達的陽性率低于對照組，IMPI也低于對照組。并且在用藥7 d的時間窗內，納米金抑制RGS－5表達作用最強。這說明納米金能通過抑制RGS－5蛋白表達，減少裸鼠肝癌組織中新生血管不成熟周細胞覆蓋，使腫瘤血管趨于正常化。電鏡觀察亦發現RGS－5表達陰性的血管壁上周細胞結構相對完整、形態正常;而對照組周細胞與基底膜及內皮細胞連接疏松。

納米金是金的微細顆粒，直徑在1～100 nm之間，與生物大分子蛋白質、核酸的大小相近。納米金易進入細胞內部，能被不同的化學基團修飾，對腫瘤細胞有靶向性特性，對正常細胞幾乎無細胞毒性。目前發現納米金能與有肝素結合位點的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)結合，抑制內皮細胞增殖、抗腫瘤血管生成［2，5］。本實驗結果表明納米金還能抑制Ang－2、RGS－5在裸鼠肝癌組織中表達，通過影響Angiopoietin/Tie－2及RGS－5信號通路，使腫瘤血管正常化。其機制仍與納米金對VEGF的拮抗作用有關。VEGF是血管生長的最主要因素，在腫瘤新生血管早期，VEGF刺激腫瘤組織大量分泌Ang－2［11］。納米金作為 VEGF拮抗劑，間接抑制了Ang－2表達;RGS－5是一種GTP酶活化蛋白，具有激活GTP酶功能，在體內的活性受磷酸化影響，主要磷酸化位點為S166［10］。納米金作為一種生物分子載體，可以進入周細胞內，與RGS－5殘基結合，抑制其磷酸化，改變周細胞生物活性。至于納米金通過何種信號通路影響周細胞胞漿內RGS－5表達，我們還在進一步研究中。

本實驗結果表明納米金在7 d時間窗內抑制Ang－2和RGS－5表達的作用最強。這時腫瘤血管趨近于正常化，有利于化療藥物和氧氣在腫瘤組織內運輸，能提高放化療抗腫瘤效果。納米金能抑制腫瘤的血管生成，促進腫瘤血管正常化;但它只能延緩腫瘤的生長速度，不能徹底殺滅癌細胞、根治腫瘤。因此在腫瘤緩慢長大過程中，腫瘤細胞不可避免地發生相互間擠壓、腫瘤組織間液壓升高，導致腫瘤組織內部最終發生缺血、乏氧及pH值改變。腫瘤這種微環境變化刺激腫瘤細胞分泌各種血管生長因子，拮抗藥物作用，最終促進了腫瘤的侵潤和生長。所以探討納米金使腫瘤血管正常化的時間窗，為進一步聯合放療或化療提供治療策略。

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