Sonic hedgehog阻斷抗體增強外周血單個核細胞抗宮頸癌HeLa細胞的作用*

孫 艷，黃莉霞，黃文浩，黃 斌

(廣東藥學院生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州 510006)

Sonic hedgehog(Shh)是刺猬因子(Hedgehog，Hh)家族的成員之一。該家族最早在果蠅中發現，并證實與果蠅體節發育有關［1］。后來科學家在高等動物中發現3種Hh分子——Shh、India hedgehog(Ihh)和Desert hedgehog(Dhh)，并證實3種Hh分子經過相同的信號通路［Patched(Ptch)/Smoothened(Smo)/glioma－ associated oncogene(Gli)］［2］在早期胚胎發育中起關鍵作用。Shh是Hh家族中研究得最多也最為清楚的，它除了作為一種重要的成形素指導組織器官發育外［3］，還參與多種病理生理過程。研究顯示，Shh高表達或Shh信號異常活化是多種腫瘤細胞惡性增殖的機制之一［4］。與此同時，有研究報道Shh可以抑制CD3抗體刺激的外周T淋巴細胞活化［5］。因此，這類腫瘤細胞中高表達的Shh分子可能通過抑制淋巴細胞功能參與其發病。本研究擬在體外外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)與HeLa細胞共培養體系中應用 Shh阻斷抗體阻斷Shh分子作用，并通過檢測外周血淋巴細胞活化、功能性細胞因子分泌以及觀察PBMCs對HeLa的殺傷效果，初步探討Shh對PBMCs殺傷HeLa細胞功能的影響，為深入了解Shh信號與腫瘤免疫的關系提供實驗依據。

材料和方法

1 細胞株和試劑

宮頸癌細胞株HeLa由廣東藥學院生物制藥研究所提供。Shh阻斷抗體、兔抗人IgG購自Santa Cruz，RPMI－1640購自Gibco，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自杭州四季青公司，CD3 PE－Cy5、CD69 FITC、CD71 FITC抗體購自BD，免疫組織化學超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒購自福州邁新公司，TaKaRa RNA PCR(AMV)kit購自 TaKaRa，人 IFN － γ ELISA kit、人 IL－10 ELISA kit購自達科為公司，人Ficoll－Hypaque淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物公司。

2 方法

2.1 免疫細胞化學技術檢測Shh在HeLa細胞中的表達 消化收集HeLa細胞，以適當密度接種于多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，37℃、飽和濕度、體積分數為5%CO2條件下培養過夜。于第2 d棄去培養液，PBS洗滌2次，質量分數為4%多聚甲醛固定15 min。免疫細胞化學檢測按試劑盒操作步驟進行，包括:H2O2處理、血清封閉、Ⅰ抗(Shh抗體，1∶1000稀釋)孵育、生物素標記的Ⅱ抗孵育、鏈霉親和素－辣根過氧化物酶結合、DAB顯色、脫水、封片。顯微鏡下觀察并拍照。取傳代多次的HeLa細胞，重復進行以上檢測。

2.2 RT－PCR檢測Shh相關信號分子表達 收集對數生長期細胞，Trizol法提取總RNA(按Trizol試劑說明操作)，逆轉錄生成cDNA。PCR擴增 Gli1、Gli2、Gli3、Ptch1和Smo基因。擴增條件為:95℃預熱5 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循環 30次，72℃ 2 min。所用的引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Primer sequences

2.3 建立正常人PBMCs與HeLa細胞共培養體系消化收集HeLa細胞，按3×105/well接種于6孔板，37℃、飽和濕度、5%CO2條件下培養過夜。于第2 d采用PBMCs分離液分離正常人外周血PBMCs，調整細胞密度，按3×106/well接種于已有He-La細胞的6孔板，建立共培養體系。于共培養體系中加入Shh阻斷抗體使其終濃度為2 mg/L。設置對照組A(僅PBMCs培養)以及對照組B(共培養體系加入兔抗人IgG抗體)。

2.4 流式細胞術檢測淋巴細胞活化 以上各組細胞培養16 h，消化收集細胞，PBS洗滌2次。加入CD3－PE－CY5、CD69－FITC和CD71－FITC抗體避光孵育25 min，洗滌1次，1%多聚甲醛固定，流式細胞儀檢測。

2.5 ELISA法檢測T細胞分泌細胞因子水平 于培養24 h、48 h、72 h后，收集以上各組上清，按試劑盒操作步驟進行ELISA檢測。主要實驗步驟包括:加樣、抗體孵育2 h、洗板3次、加酶孵育20 min、洗板3次、顯色10 min、終止顯色10 min、酶標儀讀取450 nm波長處吸光度A值。同時將標準品梯度稀釋后按以上步驟檢測，制備標準曲線。根據樣品A值計算樣品濃度。每組設置3個復孔。

3 統計學處理

結 果

1 HeLa細胞表達Shh及其信號分子

免疫細胞化學技術檢測Shh在HeLa細胞的表達結果顯示，Shh在90%以上的HeLa細胞胞漿或胞核中呈陽性表達，尤其在圓形、橢圓形HeLa細胞中呈強陽性表達，見圖1A。將HeLa細胞傳代多次后再次進行檢測的結果顯示:HeLa細胞傳代6次，Shh表達水平沒有顯著改變，見圖1B。

Figure 1.Expression of Shh in HeLa cells in vitro(×200).A:Shh was expressed in the first passage of HeLa cells in vitro;B:Shh was expressed in the sixth passage of He-La cells in vitro.圖1 Shh在HeLa細胞中的表達

RT－PCR法檢測Shh信號分子在HeLa細胞中的表達結果顯示，Shh信號受體Ptch1、Smo以及轉錄因子Gli1、Gli2、Gli3均在HeLa細胞中表達，見圖2。

Figure 2.Shh signaling molecules were expressed in HeLa cells.圖2 Shh信號分子在HeLa細胞中表達

2 Shh阻斷抗體促進淋巴細胞活化

流式細胞術檢測淋巴細胞活化的結果顯示:(1)培養16 h，對照組A CD3+細胞(T細胞)數較少;對照組B和實驗組CD3+細胞數較對照組A顯著增多，見圖3A。(2)培養16 h，對照組A和B均未見CD69+細胞，實驗組則出現較多 CD69+細胞(12.73% ±0.57%)，見圖3B。實驗組 CD69+細胞與對照組B比較差異有統計學意義(P＜0.01)，見圖3D。(3)培養36 h，實驗組CD71+細胞為(10.83±2.51)%，而對照組A和對照組B CD71+細胞均處于較低水平，見圖3C。實驗組CD71+細胞與對照組B相比差異有統計學意義(P＜0.01)，見圖3D。

3 Shh阻斷抗體促進細胞因子IFN－γ的分泌，但抑制IL－10的分泌

ELISA法檢測細胞因子分泌的結果顯示:(1)對照組A上清中IFN－γ水平在培養24 h、48 h、72 h后均保持在較低水平;而對照組B及實驗組上清中IFN－γ水平隨培養時間延長而逐漸升高。Shh阻斷抗體作用24 h、48 h、72 h，共培養體系上清中IFN－γ水平較對照組A及對照組B顯著增高，是對照組B的1.5～2倍，見圖4。(2)對照組A上清中IL－10水平在培養24 h、48 h、72 h均保持在較低水平;而對照組B及實驗組上清中IL－10水平均較對照組A有顯著升高。培養24 h、48 h、72 h，實驗組上清中IL－10水平均較對照組B顯著下降，見圖5。(3)培養24 h、48 h、72 h，實驗組、對照組 A、對照組 B 的培養上清中IL－4均維持在很低水平(＜10 ng/L)。

4 Shh阻斷抗體促進PBMCs對HeLa細胞的殺傷

形態學觀察顯示，Shh阻斷抗體作用12 h，實驗組HeLa細胞形態已開始發生變化，部分HeLa細胞變圓，細胞間隙可見細胞碎片，見圖6B;培養48 h，He-La細胞數減少，細胞碎片增多，見圖6D;培養72 h，培養體系中大部分HeLa細胞已死亡，可見較多細胞碎片，見圖6F。而未加Shh阻斷抗體的共培養體系培養12 h，HeLa細胞未見明顯的形態學改變，見圖6A;培養48 h，HeLa細胞才開始出現形態變化，部分細胞變圓，培養體系中可見細胞碎片，但大部分HeLa細胞仍為短梭形，見圖6C;培養72 h，共培養體系中仍可見較多形態正常的HeLa細胞，見圖6E。

討 論

研究顯示，Shh在腫瘤中高表達或Shh信號異常活化導致多種腫瘤，包括宮頸癌［6］的惡性增殖。但Shh是否也在體外培養的宮頸癌細胞株HeLa細胞中表達，目前尚未見報道。本研究因此首先檢測了HeLa細胞中Shh表達水平，結果表明Shh在90%以上的HeLa細胞中均有陽性表達，而且部分HeLa細胞呈強陽性表達。而鑒于Sasai等［7］曾報道體外培養的髓母細胞瘤Shh表達會嚴重下降，我們對傳代多次的HeLa細胞進行了重復檢測。結果顯示，HeLa細胞體外傳代6次，Shh表達水平仍未發生顯著改變，說明Shh的表達不會隨培養時間延長及傳代次數增多而下降。采用RT－PCR法檢測Shh信號分子，結果顯示HeLa細胞表達所有Shh信號通路分子，包括跨膜受體Ptch1、Smo蛋白以及Shh信號活化的轉錄因子 Gli1、Gli2、Gli3，提示 HeLa細胞自分泌Shh分子激活Shh信號通路，進一步證實Shh在He-La細胞中表達。

Figure 3.Anti－Shh blocking antibody promoted activation of PBMCs.A:CD3+cells significantly increased in co－cultured system at 16 h;B:CD69+cells increased in co－cultured system with 2 mg/L anti－Shh blocking antibody at 16 h;C:CD71+cells increased in co－cultured system with 2 mg/L anti－Shh blocking antibody at 36 h;D:Bar graph showed the expression of CD3，CD69 and CD71..n=3.▲▲P＜0.01 vs PBMCs;＊＊P＜0.01 vs PBMCs+HeLa.圖3 Shh阻斷抗體促進淋巴細胞活化

Figure 4.Anti－Shh blocking antibody increased the secretion of IFN－γ..n=3.＊＊P＜0.01 vs PBMCs+HeLa.圖4 Shh阻斷抗體促進IFN－γ的分泌

Figure 5.Anti－Shh antibody inhibited the secretion of IL－10..n=3.＊＊P＜0.01 vs PBMCs+HeLa.圖5 Shh阻斷抗體抑制IL－10的分泌

Figure 6.Anti－Shh antibody promoted PBMCs to kill HeLa cells(×400).A:PBMCs+HeLa(12 h);B:PBMCs+HeLa+Shh Ab(12 h);C:PBMCs+HeLa(48 h);D:PBMCs+HeLa+Shh Ab(48 h);E:PBMCs+HeLa(72 h);F:PBMCs+HeLa+Shh Ab(72 h).White arrow:PBMCs.圖6 Shh阻斷抗體增強PBMCs殺傷HeLa細胞的作用

我們進而采用Ficoll淋巴細胞分離液分離正常人PBMCs，并與HeLa細胞建立共培養體系。由于PBMCs主要是淋巴細胞和單核細胞，包含了抗腫瘤免疫的主要效應細胞T淋巴細胞和NK細胞［8－9］，因此可以在體外反映抗腫瘤功能。首先采用流式細胞術檢測淋巴細胞表達CD3、CD69和CD71分子的情況。結果顯示:與腫瘤細胞共培養16h，實驗組和對照組B CD3+細胞數目均顯著增加，達到無腫瘤細胞組的10倍左右。由于CD3主要表達于成熟T淋巴細胞和NK T細胞表面，是T淋巴細胞特異性表面標記，同時也是參與傳遞T淋巴細胞活化第一信號的重要分子［10］，因此CD3+細胞數增加表明在腫瘤細胞刺激下T淋巴細胞出現大量增殖。進一步檢測淋巴細胞早期活化標記CD69分子和活化標記CD71分子［11］，結果顯示:培養16 h，Shh阻斷抗體處理的共培養體系中出現12.7%的 CD69+細胞，而沒有Shh抗體作用的對照組B和單純PBMCs組均未出現CD69+細胞，提示Shh阻斷抗體可以促進淋巴細胞早期活化。培養36 h，Shh阻斷抗體處理組出現10%左右的CD71+細胞，而對照組B和對照組A均未見CD71+細胞，提示Shh阻斷抗體進一步促進淋巴細胞發生晚期活化。

淋巴細胞活化后會改變功能性細胞因子表達譜以完成相關的生物學功能［12］，因此細胞因子分泌種類和數量的改變也可以間接反映淋巴細胞功能狀態。采用ELISA法檢測淋巴細胞活化相關的細胞因子，結果顯示:在腫瘤細胞刺激下，實驗組和對照組B IFN－γ和IL－10的分泌增加，而IL－4的分泌在腫瘤抗原刺激與否的情況下都處于很低水平，說明IFN－γ和IL－10參與了PBMCs抗HeLa細胞作用。研究結果還顯示，Shh阻斷抗體可以使IFN－γ分泌水平增加，但使IL－10分泌水平下降。由于IFN－γ是細胞免疫應答重要的功能因子［13］，具有較好的抗病毒、抗腫瘤作用［14］，而IL－10則具有抑制細胞免疫應答的功能［15］，提示Shh阻斷抗體可以增強細胞免疫應答反應。此外，形態學觀察顯示，實驗組He-La細胞被殺傷得更快，說明Shh阻斷抗體可以促進PBMCs殺傷HeLa細胞。

綜上所述，Shh阻斷抗體可以促進PBMCs活化、分泌功能性細胞因子IFN－γ以及殺傷HeLa細胞效果，但抑制PBMCs分泌具有抑制細胞免疫功能的細胞因子IL－10，說明Shh阻斷抗體可以增強PBMCs抗宮頸癌HeLa細胞的作用。而Shh是否參與了宮頸癌發病的免疫機制還需進一步深入研究和證實。

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