艾灸對慢性疲勞大鼠免疫功能的影響

曾 進，黃 瑾，呂明莊

(1.深圳龍珠醫院，廣東 深圳518005;2.江西青峰藥業有限公司學術部，廣東 深圳518034;3.澳門科技大學醫院，澳門)

1 材料和方法

1.1 實驗動物

青年健康SD雄性大鼠36只，3～4月齡，體重(200±20)g，由貴陽醫學院實驗動物中心提供［合格證批號為SCXK－(黔)2002－0001］。

1.2 藥物及主要試劑

刀豆蛋白A(ConA)和四甲基偶氮唑鹽(MTT)均為Sigma公司產品;IL－2和TNF－α放免試劑盒(天津九鼎醫學生物工程有限公司);兔抗大鼠IL－2和兔抗大鼠TNF－α試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);PV－6001兔二步法檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 儀器

550 型酶聯免疫檢測儀(伯樂太平洋有限公司);二氧化碳培養箱(日本)。

1.4 方法

1.4.1 實驗動物分組

SD雄性大鼠36只，隨機分為正常對照組、CFS模型組、艾灸組，每組12只。

1.4.2 造模方法

適應性喂養7天，采用懸吊冷水游泳復合應激因素復制慢性疲勞動物模型，連續12天［1］。

1.4.3 治療方法

正常組:不做任何治療，每天空抓1次，共12天。模型組:不做任何治療，每天空抓1次，共12天。艾灸組:艾灸穴位肝俞、脾俞、腎俞［2］，隔日1次，每次用艾柱每穴灸1 cm。左右同時灸，灸6次，共12天。

1.4.4 標本采集

治療結束后，模型組死亡2只，感染2只，死亡原因為游泳溺水。艾灸組感染2只。剩余大鼠用10%水合氯醛麻醉(100 g/0.3 ml)，剪開腹股溝動脈，離心塑料管取血2 ml，臺式高速離心機上3 000 r/min離心10 min。吸取血清置于－30℃冰箱保存待測。

1.4.5 指標檢測

免疫器官指數:將處死后的各組大鼠分別取出胸腺、脾，去除脂肪、筋膜后稱重，計算胸腺指數和脾指數，單位mg/g體重。

脾淋巴細胞的增殖轉化能力:采用MTT法檢測脾淋巴細胞的增殖情況。無菌取脾，常規制成淋巴細胞懸液，調細胞濃度為1.5×106/ml，加入96孔板中，再加入刀豆蛋白A(終濃度為5 μg/ml)，置于CO2培養箱中60 h，培養結束前4 h加入MTT，培養結束后加入二甲基亞楓，于酶標儀570 nm處比色測定吸光度值。

IL－2和TNF－α:采用放射免疫檢測法(RIA)，按天津九鼎醫學生物工程有限公司的放免藥盒說明書操作。

HE染色觀察大鼠脾臟一般形態學變化:將分離取出稱重后脾臟放于10%中性福爾馬林固定24 h，梯度脫水，二甲苯透明、石蠟包埋，切片(3～5 um)，HE病理染色觀察脾臟一般形態學變化。

免疫組化測定:采用PV免疫組化染色法，按北京中杉金橋生物技術有限公司藥盒說明書操作。

1.4.6 圖像分析及統計學處理

用Biomias99圖象分析系統對平均光密度進行圖像分析。數據采用均數±標準差(±s)表示，采用SPSS12.0統計軟件包進行統計分析，各組間比較采用單因素方差分析(One－way ANOVE)和q檢驗。

2 結果

2.1 免疫器官指數 見表1。

表1 各組大鼠胸腺指數和脾指數比較(±s)

表1 各組大鼠胸腺指數和脾指數比較(±s)

注:與正常組比較，ΔP＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05。

2.2 脾淋巴細胞增殖轉化力 見表2。

表2 各組大鼠脾淋巴細胞增殖轉化力比較(±s)

表2 各組大鼠脾淋巴細胞增殖轉化力比較(±s)

注:與正常組比較，ΔP＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05。

2.3 血清白介素－2(IL－2)和腫瘤壞死因子 －α(TNF－α)濃度值 見表3。

表3 各組大鼠治療后血清IL－2和TNF－α濃度值比較(±s)

表3 各組大鼠治療后血清IL－2和TNF－α濃度值比較(±s)

注:與正常組比較，ΔP＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01;*P＜0.05。

2.4 HE染色結果

HE染色正常組見圖片1。模型組大鼠脾臟紅髓縮小，白髓萎縮，脾組織內脾小梁排列紊亂，中央動脈玻變。見圖2a～2b。治療組均有不同程度改善，見圖3。

圖1 正常組大鼠脾臟組織

圖2 a模型組大鼠脾臟組織

圖2 b模型組大鼠脾臟組織

2.5 免疫組化染色結果 見表4。

表4 各組大鼠IL－2和TNF－α表達的平均光密度比較(±s)

表4 各組大鼠IL－2和TNF－α表達的平均光密度比較(±s)

注:與正常組比較，ΔP＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01。

圖3 艾灸組大鼠脾臟組織

3 討論

3.1 現代醫學對CFS的認識

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)是現代醫學新認識的一種疾病，由美國疾病控制和預防中心(CDC)于1988年正式命名。這是一種以疲勞為主，伴低熱(或自覺發熱)、咽喉痛、肌痛、關節痛、頭痛、注意力不易集中、記憶力差、睡眠障礙和抑郁等非特異性表現為主的綜合征［3］。其原因尚不確定，主要有兩種學說:生物感染和由感染直接介導的免疫功能失調［4］。

3.2 免疫與CFS的關系

很多研究表明［5～6］，CFS患者存在免疫功能的異常，主要表現為細胞免疫功能低下。此外，還存在淋巴細胞增殖功能及T細胞亞群數目與比值的改變等［7］。因此，有人也將CFS稱為“慢性疲勞免疫功能障礙綜合征”。

3.2.1 胸腺指數和脾臟指數與CFS

脾臟及胸腺是淋巴細胞的生發中心，有脾細胞分泌的轉移因子(TF)及胸腺分泌的胸腺素，在免疫疾病防治中具有重要的實用價值，因此研究針灸等對免疫器官重量的影響，可推測其對免疫功能的正向調節作用。

3.2.2 脾淋巴細胞增殖轉化能力與CFS

T淋巴細胞主要介導細胞免疫，可以調節機體的免疫功能。一般認為，機體的細胞免疫功能差，淋巴細胞轉化率低;反之，細胞免疫功能良好，淋巴細胞轉化率也較高。因此，根據淋巴細胞轉化率(增殖指數)的高低，可判斷機體的細胞免疫功能狀態［8］。

3.2.3 IL－2和TNF－α與CFS

IL－2與CFS:IL－2主要由活化的CD+4T細胞及少量CD+8T細胞產生，是一種免疫調節淋巴因子。其主要生物學功能是增強NK細胞和CD8+T細胞的活性，刺激此兩種細胞產生γ干擾素(γ－INF)，并能誘導IL－1β受體的生成。它有維持T細胞在體外的生長、激活多種免疫細胞、誘導生成等作用，而且T細胞產生的IL－2可進一步刺激其自身受體的表達和分泌，其水平反映了T細胞的功能狀態，IL－2的產生能力可作為機體細胞免疫功能的重要指標。

TNF－α與CFS:TNF－α是由被激活的巨噬細胞和單核細胞產生的多膚類介質，在體內具有廣泛的生物學作用，可誘導IL－1、IL－6、血小板活化因子(PAF)等細胞因子參與機體免疫調節作用。參與了多種疾病的病理過程，在免疫調節、炎癥以及某些慢性病等細胞反應中TNF具有重要作用。有學者［9～10］對CFS患者與正常對照組進行了回顧性的對照研究，發現CFS患者與對照組比較TNF呈顯著性升高。

3.3 中醫學對CFS的認識

疲勞在《黃帝內經》中多稱為“倦”、“懈惰”、“困薄”、“身重”、“體重”、“四肢不舉”等。《素問·五藏生成論》云:“肝受血而能視，足受血而能步，掌受血而能攝”，指出肝藏血主疏泄的正常功能是人體活動能力的重要保證。脾主肌肉四肢，“脾病者身重”，“脾氣虛則四肢不用”。《黃帝內經》論述“腎足少陰之脈”，“是主腎所生病”，有“嗜臥”之癥。“各脈者腎也……太過則令人懈惰”。文獻中疲勞涉及的臟腑主要為肝脾腎三臟，與情志、勞逸、氣血、肝、脾、腎功能失調有關。

3.4 艾灸治療CFS的機理分析

艾灸的防病、治病與保健養生作用在古醫籍中早有記載。如《本草綱目》曰:“艾，外用灸百病，壯元陽，通經脈，行氣補血。”宋·竇材在《扁鵲心書·住世之法》中就有“保命之法，灼艾第一”之說。艾灸對非特異性免疫和特異性免疫功能都有一定的調節作用。在治療與免疫相關疾病過程中，艾灸具有抗感染、抗自身免疫病、抗過敏反應、抗癌和延緩衰老等作用，這主要是通過調節體內失衡的免疫功能實現的［11］。艾灸對機體的免疫調節作用也是雙重的，既能使紊亂的免疫功能向正常狀態調整，也能使正常機體的抗病能力增強，這種調節不僅體現在細胞水平，而且體現在分子水平。艾灸治療慢性疲勞大鼠未見相關文獻報道，本實驗結果表明:艾灸能使慢性疲勞大鼠脾臟指數提高、脾淋巴細胞增殖轉化能力增強、血清IL－2和TNF－α小劑量增加，從而提高了免疫功能，這也可能是艾灸治療慢性疲勞綜合征的機制之一。當然，艾灸對機體的免疫調節還表現在更多方面和更深層次，有待今后作進一步的研究。

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