英夫利昔單抗對兔骨關(guān)節(jié)炎動物模型的影響

呂洪華 張乾坤 吳雪蓮

(麗水市中心醫(yī)院,浙江 麗水 323000)

關(guān)節(jié)軟骨的丟失和破壞是骨關(guān)節(jié)炎(OA)的主要特征,越來越多的證據(jù)表明OA不僅僅是一種退變性關(guān)節(jié)炎,大量的炎癥因子如白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等參與了軟骨破壞的過程[1-2]。英夫利昔單抗(infLiximab)是一種可溶性抗TNF-α抗體,目前被廣泛用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)。本研究中作者將評價英夫利昔單抗是否對兔OA動物模型有軟骨保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 兔OA動物模型的建立 新西蘭大白兔共30只,體質(zhì)量2.1～3.0Kg,由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。10%水合氯醛(4mL/Kg)耳緣靜脈麻醉后,參照Hulth法[3]建立兔OA動物模型,單籠飼養(yǎng),鼓勵動物活動。

1.2 分組與給藥 手術(shù)后8周,30只兔子隨機(jī)分為英夫利昔單抗10mg/mL(0.5mL)組、英夫利昔單抗20mg/mL(0.5mL)組和生理鹽水(0.5mL)組,每組各10只,每月給藥1次,共3次。

1.3 關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α、NO的測定 第1次給藥3個月后,取關(guān)節(jié)積液,通過ELISA法測定IL-1β、TNF-α的含量,通過Griess法測定NO的含量。ELISA試劑盒購于上海西唐生物科技有限公司。

1.4 軟骨總體形態(tài)及微形態(tài)的觀察 第1次給藥3個月后,將動物處死,肉眼觀察股骨軟骨形態(tài)的變化。切取負(fù)重關(guān)節(jié)面帶少量軟骨下骨的全層軟骨,無菌生理鹽水沖洗后,10%中性緩沖甲醛固定液固定,5%甲酸甲醛脫鈣液脫鈣1周,加強(qiáng)梯度脫水。二甲苯I透明20分鐘,浸蠟2小時,Leica EG1140H石蠟包埋儀包埋成石蠟塊,制成石蠟切片。行HE染色,OLympus BH-2光學(xué)顯微鏡觀察并拍攝照片。結(jié)果分析按照Mankin評分標(biāo)準(zhǔn)由兩名觀察者分別獨(dú)立進(jìn)行評分,取均值。

2 結(jié) 果

2.1 關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α、NO 的表達(dá) 表1顯示各組關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α及NO表達(dá)水平,其中TNF-α及NO表達(dá)水平兩治療組均顯著低于生理鹽水組(P＜0.05),兩治療組之間無顯著性差異(P＞0.05)。IL-1β的表達(dá)水平兩治療組與生理鹽水組之間無顯著性差異(P＞0.05)。

表1 各組關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α、NO濃度比較

2.2 軟骨總體形態(tài)變化 正常兔膝關(guān)節(jié)軟骨表面平滑有光澤,呈淺藍(lán)白色。在生理鹽水組中,軟骨呈黃白色,無光澤,可見明顯的裂縫和軟骨缺失,股骨髁狀突可見骨贅形成(見第467頁圖1A)。在兩治療組中,仍可見軟骨丟失,但嚴(yán)重程度較生理鹽水組明顯減輕(見第467頁圖1B、圖1C)。

2.3 軟骨微形態(tài)變化 生理鹽水組可見軟骨很薄,潰瘍深達(dá)鈣化層伴軟骨下骨暴露,部分可見軟骨結(jié)構(gòu)完全破壞,細(xì)胞數(shù)目大量減少,可見梭形細(xì)胞,HE染色減少,部分軟骨不著色,潮線被破壞并可見鈣化層與軟骨下骨的破壞(見第467頁圖2A)。治療組可見軟骨較薄,裂隙可深至鈣化層,部分區(qū)域軟骨結(jié)構(gòu)完全破壞,軟骨細(xì)胞的數(shù)量減少,HE染色減弱,潮線被破壞并可見鈣化層和軟骨下骨的破壞,程度均較生理鹽水組減輕(見第467頁圖2B、圖2C)。Mankin's評分顯示英夫利昔單抗10mg/mL組(2.7±0.9)、英夫利昔單抗20mg/mL組(2.4±0.7),明顯低于生理鹽水組(6.4±1.2)(P＜0.05)(表2)。兩治療組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 3組軟骨組織學(xué)評分

3 討 論

近年來生物因子在OA發(fā)病發(fā)展中的作用日益受到重視,生物因子網(wǎng)絡(luò)失調(diào)與OA發(fā)病以及病程進(jìn)展關(guān)系密切,IL-1β、TNF-α、NO作為體內(nèi)重要的炎性介質(zhì),可導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的水平增高,從而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡、造成關(guān)節(jié)軟骨的損傷[4-5]。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)英夫利昔單抗可有效的降低關(guān)節(jié)液中TNF-α、NO的表達(dá)水平,而對IL-1β的表達(dá)水平無顯著影響。TNF-a和IL-1β是由OA患者軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的,可激活誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)表達(dá),產(chǎn)生NO,從而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。目前,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為TNF-a和IL-1β等在關(guān)節(jié)軟骨代謝方面處在炎癥因子的上游,而NO在處于炎癥因子的下游,起信使傳遞作用[6]。故認(rèn)為英夫利昔單抗通過抑制TNF-α降低了NO的表達(dá)水平。

Mankin評分是研究軟骨組織損傷程度的經(jīng)典方法,結(jié)合軟骨的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞數(shù)量、基質(zhì)異染性和潮線完整性等四個方面進(jìn)行評分。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),兩治療組在軟骨總體結(jié)構(gòu)、軟骨微結(jié)構(gòu)、Mankin評分等方面均優(yōu)于生理鹽水組,提示英夫利昔單抗能從組織學(xué)水平上改善兔骨關(guān)節(jié)軟骨的損傷進(jìn)程,無濃度依賴性,但是尚不能最終阻止軟骨退變和發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程。

由于對OA確切的發(fā)病機(jī)制不清楚,目前對于OA的治療上無論是藥物還是手術(shù)都只能是對癥處理,而不能從根本上針對OA的病因進(jìn)行治療。近年來隨著對細(xì)胞因子(CK)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、生物自由基(如NO)及細(xì)胞凋亡在OA發(fā)病中的研究的深入,讓人們看到了尋找在分子生物學(xué)水平上阻斷骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的藥物的希望,英夫利昔單抗有可能成為骨關(guān)節(jié)炎治療的一種新的手段。

[1]Fernandes J C,MarteL-PeLLetier J,PeLLetierJ P.The roLe of cytokines inosteoarthritis pathophysioLogy.BiorheoLogy,2002,39(1)∶237

[2]Loeser R F.MoLecuLar mechanisms of cartiLage destruction in osteoarthritis.J MuscuLoskeLet NeuronaL Interact,2008,8(4)∶303

[3]Hulth A,Lindberg L,Telhang H.Experimental osteoarthritis in rabbits.Acta orhop,1970,41∶522

[4]Rajamaki,Sorsa.Osteoarthritis∶Linking nitric oxide and metaLLo-Proteinases in canine articuLar Ligament PathoLogy.Vet J,2006,172(3)∶400

[5]White W B.The PotentiaL roLe of nitric oxide in cardiovascuLar safety when treating osteoarthritis in Patients with hyPertension.Am[J]Med,2009,122(5)∶1

[6]Nee L,S O'ConneLL,S NoLan,et al.Nitric oxide invoLvement in TNF-alpha and IL-1 beta-mediated changes in human mesangiaL ceLL MMP-9 and TIMP-1.Nephron Exp NephroL,2008,110(2)∶59