自噬相關蛋白Beclin-1在乳腺浸潤性導管癌中的表達及臨床意義

顧棟樺 徐 煒 董吉順 平金良

(湖州市中心醫院,浙江 湖州 313000)

Beclin-1是一個自噬(autophage)相關蛋白,參與細胞的凋亡、自噬及增殖等過程的調節。研究發現許多惡性腫瘤中Beclin-1表達降低或缺失,在腫瘤的發生和發展過程中發揮重要作用[1]。Beclin-1在乳腺癌中的作用和機制目前了解較少,本實驗通過免疫組織化學的方法檢測乳腺浸潤性導管癌中Beclin-1的表達,探討其與乳腺癌臨床病理參數的關系及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院2005～2010年外科改良根治的72例原發乳腺浸潤性導管癌及配對癌旁乳腺存檔石蠟組織塊,所有患者術前均未接受過放化療及生物治療,均為女性,年齡28～65歲,中位年齡44歲。其中34例伴淋巴結轉移,臨床TNM分期按美國癌癥聯合委員會(AJCC)標準[2],Ⅰ-Ⅱ期47例,Ⅲ-Ⅳ期25例。組織切片由兩名高年資病理醫生按WHO分級標準進行病理分級[3]；另選取乳腺良性病變21例(包括10例乳腺纖維腺瘤、5例單純性乳腺導管上皮增生和6例乳腺小葉增生)作為對照組,所有組織均經4%中性甲醛固定,常規脫水浸蠟,常溫保存。

1.2 方法 考察Beclin-1在乳腺浸潤性導管癌、癌旁乳腺組織及乳腺良性病變中的表達情況,以及Beclin-1的表達與各病理臨床參數(腫瘤大小、患者年齡、TNM分期、病理分級、ki-67陽性分級及淋巴結轉移情況)之間的關系。

1.2.1 免疫組織化學 免疫組織化學采用EnVision二步法；小鼠抗人ki-67抗體(工作濃度均為l∶200)以及EnVision試劑盒均為丹麥Dako公司產品,兔抗人Beclin-1多克隆抗體(工作濃度1∶100)購于英國Abcam公司。石蠟切片厚度4μ m。實驗步驟參照試劑盒說明書進行,簡述如下∶切片脫蠟至水,微波修復抗原,3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶活性,TBS漂洗3次×5分鐘,滴加一抗,37℃孵育1小時,TBS漂洗3次×5分鐘,EnVision試劑37℃孵育30分鐘,TBS漂洗3次×5分鐘,3,3-二氨基聯苯胺(DAB)顯色,蘇木精襯染、脫水透明、封片。用TBS代替一抗做為空白對照,組織中正常乳腺導管上皮為陽性對照。

1.2.2 結果評定 采用雙盲閱片,信號強度半定量評分參考文獻[4],每張切片隨機選5個200倍視野觀察,計算陽性細胞百分率。Beclin-1蛋白以細胞質出現棕黃或棕紅色顆粒為陽性信號,陽性細胞百分率＜30%為陰性(-),30%～60%之間為(+),＞60%為(++)；Ki-67以細胞核出現棕黃或棕紅色顆粒為陽性信號,＜5%為(-),＜25%為(+),＜50%為(++),≥50%為(+++)。

1.3 統計學處理 應用SPSS13.5軟件對數據結果進行統計分析,組間比較采用 χ2檢驗。

2 結 果

2.1 Beclin-1在乳腺浸潤性導管癌中的表達Beclin-1主要表達于細胞質中,呈現棕黃或棕紅顆粒,癌旁正常乳腺組織及乳腺良性病變組中Beclin-1陽性率均為100%,陽性信號主要分布于乳腺導管上皮細胞質中(見第467頁圖1)；而乳腺浸潤性導管癌中Beclin-1陽性信號主要定位于腫瘤細胞質中(見第 467頁圖2),陽性率為47.2%(34/72例),與乳腺良性病變及癌旁乳腺組織相比Beclin-1表達明顯下調,具有顯著性差異(χ2值分別為18.74和51.63,均 P＜0.01),詳見表1。

表1 Beclin-1在乳腺病變組織中的表達

2.2 Beclin-1表達與臨床病理參數的關系Beclin-1的表達與乳腺癌的病理分級有關(P＜0.05),與腫瘤的大小、患者年齡、TMN分期及淋巴結轉移情況無關(均P＞0.05)。作者按ki-67細胞陽性率把腫瘤分為低增殖(+～++)和高增殖組(+++),顯示高增殖組的Beclin-1陽性率明顯低于低增殖組(P＜0.05),詳見表2。

表2 Beclin-1的表達與病理臨床參數之間的關系

3 討 論

自噬是細胞在遇到環境壓力(如營養缺乏、缺氧、毒性藥物等)時,在細胞內形成具有雙層或多層包膜包裹細胞器形成吞噬泡,繼而發生細胞器的降解和轉化,自噬的最終結局是細胞程序性死亡。目前發現許多腫瘤細胞出現自噬功能的異常,但其機制尚不清楚[5]。Beclin-1是Liang等通過酵母雙雜交發現的一個能與Bcl-2相互作用的蛋白,參與自噬活性的調節,并且在許多腫瘤組織中表達降低甚至缺失[6]。研究發現用外源性的Beclin-1基因導入乳腺癌MCF-7細胞株后,細胞自噬增強,腫瘤細胞的體外增殖能力明顯降低。該研究還發現,從正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤、交界性卵巢腫瘤到上皮性卵巢癌組織,Beclin-1的表達逐漸下調[7]。在食管癌[8]、胃癌組織[9]中,Beclin-1的表達也呈明顯降低的趨勢。因此,Beclin-1可能是一個抑癌基因,在腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用。

本實驗中,Beclin-1表達陽性率在癌旁乳腺組織及乳腺良性病變組織中均為100%,說明Beclin-1在正常乳腺的生長和生理過程調控中可能發揮重要作用。免疫組化結果顯示72例乳腺浸潤性導管癌組織中Beclin-1的表達陽性率只有47.2%,部分病例Beclin-1蛋白表達減少甚至缺失；并且其表達與腫瘤的病理分級有關(P＜0.05),分化越差Beclin-1陽性率越低,提示Beclin-1的下調可能是導致乳腺癌發展的因素。細胞增殖能力是影響腫瘤預后的重要影響因素,ki-67細胞陽性率是判斷細胞增殖能力的常用參考指標。作者把乳腺癌分為兩組∶ki-67高表達組及低表達組,結果顯示ki-67低表達組的Beclin-1陽性率明顯高于ki-67高表達組,意味著Beclin-1表達降低與腫瘤細胞增殖能力的增高有關。但Beclin-1調控細胞增殖的機制尚不清楚,有待進一步研究。

[1]趙劍虹,萬小云,謝幸.自噬相關基因Beclin 1與腫瘤.國際遺傳學雜志,2007,30(1)∶48

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[5]Chen N,Karantza-Wadsworth V.Role and regulation of autophagy in cancer.Biochim Biophys Acta,2009,1793(9)∶1516

[6]Liang X H,Kleeman L K,Jiang H H,et al.Protection against fatal Sindbis virus encephalitis by beclin,a novel Bcl-2-interacting protein.J Virol,1998,72(11)∶8586

[7]Liang X H,JacksonS,Seaman M,et al.Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin 1.Nature,1999,402(6762)∶672

[8]單國用,劉興安,張松,等.食管鱗狀細胞癌組織中自噬基因Beclin 1蛋白的表達.鄭州大學學報(醫學版),2010,45(3)∶366

[9]郭長青,邵經浩,盧瑞利,等.胃癌組織中Beclin 1和PTEN蛋白的表達.鄭州大學學報(醫學版),2010,45(3)∶463