從RNA酶解液中分離5′-尿苷酸

李德瑩，丁慶豹

(1.三峽大學化學與生命科學學院，湖北 宜昌 443002；2.華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237)

核苷、核苷酸是構成生物遺傳信息DNA和RNA的基礎，在生物細胞的物質代謝和能量轉換中起著重要作用。核酸的分解產物及其衍生物在食品、醫藥和保健領域應用廣泛[1～3]。核苷酸類物質的應用源于5′-肌苷酸呈鮮味性質的發現，20世紀70年代以來，核苷酸及其衍生物在抗病毒和抗癌方面受到醫藥界的普遍重視，現在普遍使用的利巴韋林、齊多夫定、拉米夫定、氟鐵龍等均為核苷酸的衍生物。其中尿苷酸(UMP)參與肝解毒物質葡萄糖醛酸酐的生物合成，用于治療肝炎，還可作為生產核酸類藥物、保健食品及生化試劑的中間體，如用于合成尿苷三磷酸(UTP)、聚腺尿、氟鐵龍等藥物。

傳統的UMP制備方法通常是先采用1根陽離子交換柱分離4種單核苷酸[4～6]，分別得到UMP、胞苷酸(CMP)、腺苷酸(AMP)的稀溶液和鳥苷酸(GMP)、CMP的混合液；再將UMP調pH值后，上陰柱分離純化、濃縮。該法存在樹脂利用率低、4種核苷酸不易完全分離、UMP的質量較差、分離周期較長、環境溫度較高時上柱液容易滋生微生物等問題；若要進行工業化生產，還需要增加洗脫液貯罐[7]。肖林平[8]研究了一種新的陽離子交換樹脂，可以將4種核苷酸在該陽柱上分離，但各產品色譜峰之間幾乎沒有距離，導致流出液產品收集存在一定困難。

作者在此采用串聯的陽離子交換柱在酸性條件下首先吸附AMP、CMP和GMP，未經吸附的UMP流經弱堿性樹脂柱和強堿性樹脂柱后，經洗脫、濃縮、干燥，得到高純度的UMP。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

麥芽根、酵母RNA，上海線磊生物科技有限公司；001×8、D301、D312、717樹脂，華東理工大學華震公司；實驗用試劑均為市售化學純。

紫外分析儀，752型紫外可見分光光度計，超級恒溫水浴，酸度計，島津高效液相色譜儀。

1.2 方法

利用麥芽根內提取的磷酸二酯酶作用于酵母RNA，可同時獲得4種5′-單核苷酸，即5′-腺苷酸(AMP)、5′-胞苷酸(CMP)、5′-鳥苷酸(GMP)和5′-尿苷酸(UMP)。AMP、CMP、GMP在pH值1.5時所帶的正電荷不同，強弱順序依次為AMP>CMP>GMP；UMP因為沒有氨基解離，帶負電荷，從而不被陽離子樹脂吸附而直接從柱上流出。因此，首先用陽離子樹脂吸附AMP、CMP和GMP，從而將UMP單獨分離出來。

1.2.1 磷酸二酯酶的制備[9，10]

稱取100 g麥芽根(金黃色，無異味，雜質少)，加入800 mL去離子水，于室溫(低于25 ℃)浸泡16 h后，置于組織搗碎機粉碎，用尼龍布擠出浸汁，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 酵母RNA的酶解

將200 mL磷酸二酯酶酶液加到2 L 1%的酵母RNA溶液中，于70 ℃攪拌反應2 h，反應停止后，迅速升溫至90 ℃，加入少量硅藻土、活性炭過濾，濾液經超濾處理。

1.2.3 UMP的分離

采用4柱串聯的方法。即2根陽柱與2根陰柱串聯，其中1#與2#柱裝填強酸性陽離子交換樹脂001×8、3#柱裝填大孔弱堿性陰離子交換樹脂D312、4#柱裝填強堿性陰離子交換樹脂717。將酵母RNA酶解液依次經過4柱處理后，用2 mol·L-1的HCl調pH值為1.5。

1.3 分析檢測

1.3.1 5′-核苷酸的鑒定

1.3.1.1 比值分析

將洗脫液的吸光度比值(A250/A260、A280/A260)與文獻值比較，定性判斷核苷酸種類[11]。4種核苷酸的標準吸光度比值見表1。

表1 4種核苷酸的吸光度比值

1.3.1.2 瓊脂糖電泳

取適量瓊脂糖水浴加熱溶解，加入pH值3.5的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液，混勻，趁熱吸取3.7 mL鋪在2.5 cm×7.5 cm的白料玻璃板上。冷卻凝固后距一端1.5 cm處開一狹縫，注入樣品液，以點樣處為負極，電壓約300 V，于電泳儀上電泳5 min。將電泳后的瓊脂糖凝膠板移入紫外分析儀中觀察。

1.3.2 5′-核苷酸的純度分析

采用高效液相色譜儀測定洗脫流出液中4種核苷酸的濃度[12，13]。色譜條件如下：Shim-pack VP-ODS色譜柱(4.6 mm×150 mm)；流動相為pH值5.5的0.05 mol·L-1乙酸胺溶液；流速1 mL·min-1；紫外檢測波長254 nm；柱壓5.8 MPa。

1.3.3 UMP的收率計算

2 結果與討論

2.1 UMP的陽柱分離

將1800 mL RNA酶解液按序通過1#、2#串聯柱，1#裝柱量為250 mL，2#裝柱量為380 mL，流速約200～250 mL·h-1。檢測2#柱出口，經吸光度比值分析，上樣時陽柱的流出液為UMP；上樣完畢后，陽柱中還殘留有少量的UMP，用0.01 mol·L-1的HCl洗柱，流速200～250 mL·h-1。流出曲線如圖1所示。

圖1 UMP流出曲線

由圖1可知，流出液體積約2 L后，260 nm下的吸光度值很小，意味著柱出口處未檢測到核苷酸。在隨后的繼續洗脫過程中，經過一段空白后，2#柱出口處得到GMP。經HPLC分析，收集的1.8 L流出液中僅可檢測出UMP，未檢測出其它3種核苷酸，這表明使用1.8 L強酸性陽離子交換樹脂可以將UMP與其它核苷酸分離。因此可采用4柱串聯方式，將殘留在1#、2#、3#柱中的5′-UMP全部洗至4#柱，控制操作條件將AMP保留在1#柱，CMP、GMP保留在2#柱，便于其分離。

2.2 UMP流出液的陰柱純化與濃縮

通過瓊脂糖電泳分析陽柱流出液，發現在UMP的前端(正極端)仍有兩條明顯的雜質帶，說明RNA酶解液中含有比UMP帶有更多負電荷的物質，在陽柱分離的過程中，這些物質與UMP一起流出。若直接對UMP流出液進行陰離子交換樹脂濃縮，對后期UMP的結晶影響較大，幾乎得不到UMP的結晶。考慮到主要雜質所帶的負電荷明顯大于UMP，采用弱堿性的大孔陰離子交換樹脂(3#柱)對這些物質進行吸附，并用0.01 mol·L-1HCl洗脫吸附在弱堿性陰離子交換樹脂上的UMP。經此處理，UMP流出液電泳只有一條帶，無明顯的雜質帶，且后期得到晶形非常好的固體UMP。

2.2.1 3#柱樹脂種類與用量的選擇

3#柱采用大孔弱堿性陰離子交換樹脂D301，裝柱量為100 mL；4#柱采用強堿性陰離子交換樹脂717，裝柱量為100 mL。3#柱的作用一方面是對含有雜質的UMP流出液進行純化，另一方面是起到調節pH值的作用。UMP在pH值較高時，其磷酸基和烯醇式基團均解離帶負電荷，可被陰離子交換樹脂所吸附，在pH值2.0～2.5范圍內上述基團離解度降低。而陽柱流出液的pH值為1.0～1.5，此時UMP是不可能被陰離子交換樹脂吸附的，但是當其通過大孔陰離子交換樹脂后，溶液的pH值會升高到9.0～11.0。因此，3#柱的離子交換樹脂種類與裝柱量是關鍵的因素。

當3#柱的樹脂量為100 mL時，將1800 mL RNA酶解液按序通過1#、2#、3#、4#串聯柱，結果發現4#柱的流出液中UMP漏穿，檢測漏穿時3#柱的出口pH值為1.5，說明3#柱的樹脂量偏低。于是將3#柱的樹脂量增加到150 mL，漏穿現象仍然發生，此時，3#、4#柱的出口pH值變化見圖2。

圖2 3#、4#柱的出口pH值(3#柱的樹脂量為150 mL)

由圖2可見，在流出體積為1600 mL時，3#柱的出口pH值迅速降到2.5以下，說明3#柱的樹脂量仍然偏低，對pH值的緩沖能力達不到要求。

將3#柱的樹脂量增加到200 mL，并改用交換容量比較大的D312樹脂，檢測3#柱出口pH值為8.5，4#柱出口pH值為7.0，流出液中UMP未漏穿，但有部分UMP被吸附到3#柱。采用pH值2.0的稀鹽酸溶液洗滌3#柱，可將UMP全部洗出，而雜質全部留在3#柱。3#柱樹脂種類及用量對UMP純化的影響見表2。

表2 3#柱樹脂種類及用量對UMP純化的影響

由表2可知，采用D312樹脂，裝柱量為200 mL時的純化效果最好，UMP收率高達92.1%。

2.2.2 4#柱洗脫劑的選擇

若4#柱未漏穿，則采用0.01 mol·L-1HCl洗柱，將UMP全部洗至4#柱，然后斷開3#柱與4#柱，對4#柱進行洗脫。分別采用0.01 mol·L-1HCl、0.03 mol·L-1HCl作為洗脫劑，發現洗脫液體積過大，洗脫液中雜質含量較高。改用0.01 mol·L-1HCl-0.5 mol·L-1NaCl洗脫4#柱，洗脫曲線見圖3。

圖3 4#柱UMP洗脫曲線

洗脫所得到的UMP的吸光度比值與標準品的相比有一些偏差，這可能是因為洗脫劑的離子強度較高，將一些吸附較牢的雜質也洗脫下來的緣故。因此，降低NaCl濃度至0.2 mol·L-1進行洗脫，結果見表3。

表3 洗脫劑對UMP純化的影響

由表3可見，用0.01 mol·L-1HCl-0.2 mol·L-1NaCl洗脫下的UMP吸光度比值與用0.01 mol·L-1HCl-0.5 mol·L-1NaCl的吸光度比值接近，說明降低NaCl濃度對提高其洗脫選擇性并未起到明顯作用，但前者洗脫液總體積為390 mL，相比于后者洗脫液總體積300 mL，增加幅度較大，對后續的乙醇結晶不利。因此，選用0.01 mol·L-1HCl-0.5 mol·L-1NaCl作為洗脫劑，雖然所得溶液中含有雜質，但經瓊脂糖電泳分析其含量非常少，而且分離后的結晶也是一個純化過程，極少量的雜質不會沉淀出來。

收集液加入少量糖用活性炭，60 ℃水浴保溫30 min，用砂芯漏斗過濾，然后調pH值至7.0～7.5。加入3 BV 95%的乙醇，攪拌、靜置后用無水乙醇洗滌，真空干燥即得固體UMP，純度達86%以上。

3 結論

先采用2根強酸性陽離子交換柱串聯操作，使得AMP保留在1#柱，可以有效解決洗脫液用量過多、濃度低的問題；再采用大孔弱堿性陰離子交換樹脂，有效去除陽柱分離時上柱流出液中的雜質，并自動調節4#柱的pH值使其有利于UMP吸附；最后直接從4#柱洗脫得到純度較高的UMP，結晶純度達86%以上，收率92.1%。縮短了分離周期，節省了設備成本。

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