Eu3+對槲皮素與BSA相互作用的影響

張懷斌，張曉帆，李懷祥

(1.濱州醫學院(煙臺校區)藥學院，山東 煙臺 264003；2.山東師范大學化學化工與材料科學學院，山東 濟南 250014)

血清白蛋白(Serum albumin，SA)是血漿中含量最豐富的載體蛋白[1]。牛血清白蛋白(BSA)因與人血清白蛋白(HSA)具有相似的結構，常被作為體外模型進行研究[2]。蛋白質分子中因含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸而產生內源性熒光，因此可為藥物與血清白蛋白的結合作用研究提供有用的信息，為研究藥物在體內的分布、藥效的發揮等提供重要的依據[3，4]。

槲皮素(Quercetin，Que)是自然界廣泛分布的一種黃酮類化合物，生物活性顯著，具有抗氧化、抗癌、消炎及清除自由基等功效[5]。槲皮素與生物大分子的結合作用已成為研究者關注的焦點，其中針對Que與BSA的結合作用已有相關研究[3～9]。Que 結構中存在3-羥基-4-酮、3′，4′-二羥基、5-羥基-4-酮三個配位點，可與金屬離子形成穩定的配位結構[3，4]。研究發現，Zn2+存在下Que與BSA的結合作用減弱；而呂鑒泉等[9]發現Ca2+能夠使Que與BSA的結合作用增強。可見，不同金屬離子對Que與BSA的結合作用會產生不同的影響。近年來稀土在農業、材料及生物醫學等領域的應用日益廣泛，稀土在應用過程中對生命體健康的影響成為人們關注的重點[10，11]。

熒光光譜是研究蛋白質與小分子作用的重要手段。當血清白蛋白與某些小分子結合后會導致熒光猝滅，其猝滅機制常根據Stern-Volmer方程[8，9，12]確定：

F0/F=1+KSVcq=1+Kqτ0cq

(1)

式中:F和F0分別為有、無猝滅劑時體系的熒光強度；KSV為Stern-Volmer猝滅常數；cq為猝滅劑的濃度；Kq為熒光猝滅速率常數；τ0為無猝滅劑時生物大分子的平均壽命(約為10-8s)。

在靜態猝滅作用中，存在：

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlgcq

(2)

以lg[(F0-F)/F]對lgcq作圖可求得蛋白質與小分子的結合常數KA及結合位點數n，當溫度變化不大時，結合反應的焓變△H可看成一個常數，根據熱力學公式(3)、(4)可求得結合作用的熱力學參數[2，8]。

ln(K2/K1)=△H(1/T1-1/T2)/R

(3)

△G=△H-T△S=-RTlnK

(4)

鑒于此，作者以Que為藥物小分子、BSA為藥物作用的底物，采用熒光光譜、紫外吸收光譜、紅外光譜研究稀土離子Eu3+對Que與BSA結合作用的影響，分析了Eu3+存在下結合作用減弱的原因，擬為其在生物醫學領域的研究與應用提供有價值的信息。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白(純度>98%)、槲皮素(生化試劑)，上海生物工程有限公司；Tris試劑、氯化鈉、鹽酸、氧化銪，均為分析純；溶劑為二次去離子水。將氧化銪按化學反應劑量溶于鹽酸中，配制成1.0×10-2mol·L-1的EuCl3溶液；用pH值為7.4的0.1 mol·L-1Tris-HCl緩沖溶液(內含0.05 mol·L-1NaCl維持離子強度)配制濃度為1.01×10-6mol·L-1的BSA溶液；配制濃度為1.1×10-4mol·L-1的甲醇水溶液(1∶1，體積比)。

LS-55型熒光分光光度計，美國Perkin Elmer公司；WQF-510 FTIR型傅立葉紅外光譜儀，北京瑞利分析儀器公司；756PC型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；XW-80A型旋渦混合器，上海醫大儀器廠；PHS-3C型酸度計，上海精密儀器有限公司；DK-S型兩孔四列恒溫水浴鍋，煙臺龍口先科儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 熒光光譜測定

取3 mL BSA于石英比色皿中，分別加入不同量的Que(每次加入10 μL，加入總體積<100 μL，忽略體積對濃度的影響)，固定激發波長為285 nm、熒光發射與激發狹縫寬度比為6∶8、掃描速率為500 nm·min-1，分別于溫度為299 K、311 K時測定BSA 300～450 nm的發射光譜，記錄350 nm處的熒光強度。

在上述溶液中維持Eu3+的濃度分別為1.0×10-6mol·L-1、1.0×10-5mol·L-1、1.0×10-4mol·L-1，重復上述步驟。

1.2.2 紫外光譜、紅外光譜測定

在pH值為7.4的Tris-HCl介質中，測定Eu3+與Que摩爾比為0、1∶3、2∶3、3∶3時的紫外光譜。

Eu3+與Que以摩爾比2∶1混合，靜置18 h，用去離子水反復洗滌、離心，干燥后測定紅外光譜。

2 結果與討論

2.1 Eu3+存在下，Que對BSA熒光猝滅的影響

圖1A～D分別為Eu3+濃度為0 mol·L-1、1.0×10-6mol·L-1、1.0×10-5mol·L-1、1.0×10-4mol·L-1條件下，Que對BSA熒光光譜猝滅的影響。

cq(×10-8 mol·L-1)，1～6:3.7，7.4，11.1，15.1，18.5，22.2

由圖1A可知，BSA的最大發射峰位于350 nm處，隨著Que濃度的增大，BSA的熒光強度有規律地降低，最大發射峰從350 nm藍移至347 nm，BSA的峰形沒有發生變化。表明Que與BSA之間發生了結合作用，但沒有破壞BSA的發色團。BSA溶液中加入Eu3+后，隨著Eu3+濃度的增大，BSA熒光光譜略有藍移，當Eu3+濃度為1.0×10-4mol·L-1時藍移0.9 nm(圖1D)。Eu3+存在下Que對BSA的熒光猝滅程度減小，發射峰藍移程度也減小，但峰形沒有發生明顯變化。說明Eu3+對Que與BSA的結合作用具有一定的影響。

根據Stern-Volmer方程作出Que對BSA熒光猝滅的Stern-Volmer曲線，如圖2所示。

圖2 Eu3+存在下，Que與BSA結合作用的Stern-Volmer曲線

由直線的斜率求出299 K時不同Eu3+濃度下Que對BSA的猝滅常數KSV和猝滅速率常數Kq，結果見表1。

表1 不同Eu3+濃度下，Que對BSA的猝滅常數及猝滅速率常數

由表1可以看出，Kq值均遠大于動態擴散控制的猝滅速率常數1010L·mol-1·s-1[13]，初步推測靜態猝滅在整個猝滅過程中起主導作用；Eu3+的存在，使Que對BSA的猝滅作用減弱，但沒有改變Que與BSA的作用機制。

動態猝滅隨溫度的升高，有效碰撞加劇，猝滅常數增大；靜態猝滅則相反[13]。圖3為299 K、311 K時Que與BSA結合作用的Stern-Volmer曲線。

圖3 不同溫度下，Que與BSA結合作用的Stern-Volmer曲線

由圖3可以看出，猝滅常數隨溫度升高而減小，進一步證明靜態猝滅在整個過程中占主導作用。

2.2 Eu3+對Que與BSA結合作用及熱力學參數的影響

以lg[(F0-F)/F]對lgcq作圖，結果見圖4；回歸方程及299 K時Que與BSA的結合常數KA、結合位點數n、相關系數見表2；不同溫度下的熱力學參數見表3。

圖4 lg[(F0-F)/F]與lgcq的關系

表2 不同Eu3+濃度下，Que與BSA結合的回歸方程、結合常數、結合位點數及相關系數(T=299 K)

表3 不同溫度下的熱力學參數

由表2可以看出，隨著Eu3+濃度的增大，Que與BSA的KA及n均逐漸減小，其相關系數也相應減小。說明Eu3+影響了Que與BSA的結合作用。

由表3可以看出，隨著溫度的升高，不管Eu3+是否存在，Que與BSA的結合常數KA均增大。

2.3 Eu3+存在下Que與BSA結合作用減弱的因素分析

Chen在研究Zn2+對Que與BSA結合作用的影響時指出[3，4]：Zn2+能夠使BSA的發射峰顯著藍移及BSA與Que結合作用的猝滅速率常數增大、結合常數減小；Zn2+存在下Que與BSA的結合在很大程度上是Zn2+-Que與BSA的結合作用。而在本實驗中，將Eu3+加入到BSA中，BSA的發射峰位置并未發生明顯藍移，當其濃度達到1.0×10-4mol·L-1時，僅藍移0.9 nm，且Eu3+的存在使得Que對BSA作用時藍移程度降低(圖1)。Eu3+的存在，雖未改變Que對BSA的猝滅機制，但其猝滅常數、猝滅速率常數及結合常數均減小，這說明，Eu3+阻礙了Que與BSA的結合，并未參與協同猝滅。此外，從表2可知，體系中Eu3+濃度的增大，lg[(F0-F)/F]與lgcq之間的相關系數R減小；當Eu3+濃度為1.0×10-4mol·L-1時，R值較大地偏離1.000，這也進一步說明Eu3+的存在影響了Que與BSA的結合作用，當Eu3+濃度增大到一定程度時，有可能改變Que與BSA的作用機制。這些表明Eu3+對Que與BSA結合作用的影響與Zn2+相比有所差別。

Eu3+存在時Que與BSA的結合作用減弱，可能有如下幾點原因：

(1)在pH=7.4時，BSA(等電點約為4.6)帶有較多負電荷，Eu3+帶有3個正電荷，Eu3+與BSA有較強的靜電引力，在作用過程中有競爭作用，很大程度上限制了Que與BSA的結合。文獻[11]中Eu3+與人血清白蛋白的結合常數為1012L·mol-1，而本實驗中Que與BSA的結合常數為105L·mol-1，Eu3+與牛血清白蛋白的結合常數遠遠大于Que與BSA的結合常數，因此，在Eu3+、Que同時與BSA作用時產生競爭作用，使得Que與BSA的結合常數減小。

(2)Eu3+與BSA的結合及大量的Eu3+分散在BSA外側，增大了Que與BSA之間的阻力，使二者的結合作用變得困難，要發生同樣的作用需要更多的能量。從表3可知：△S>0，分子之間的相互作用力主要為疏水作用力；△G<0，反應可自發進行；△H>0，反應是吸熱過程，溫度升高有利于反應向正反應進行，因此結合常數隨溫度升高而增大[14]。Eu3+存在下改變了BSA的結構及微環境，△G雖然仍小于零，但與不存在時相比有所增大，自發進行反應的趨勢降低，同時△H、△S有所增大，說明Que與BSA發生相同的變化需要吸收的熱量更多，Eu3+存在時，反應熵驅動過程更明顯。這進一步證實Eu3+的存在不利于Que與BSA的結合。

(3)有可能生成Eu3+-Que配合物，抑制Que與BSA的結合。Que在紫外區有2個吸收帶，分別位于256 nm和375 nm[4]。從pH值為7.4的Tris-HCl介質中不同Eu3+與Que摩爾比的紫外光譜(圖5)可以看出，256 nm和375 nm兩吸收帶分別紅移到了290 nm和392 nm，并且在320 nm處出現一弱的吸收峰，這可能與介質溶液及Que的存在形式有關。隨著Eu3+濃度的增大，290 nm和392 nm處吸收強度明顯減弱，320 nm吸收帶增強，290 nm和320 nm吸收帶分別紅移了4 nm和10 nm，460 nm處出現一新的吸收峰且吸收強度不斷增大，在278 nm、352 nm、430 nm處出現3個等吸收點。上述結果顯示，在pH值為7.4的Tris-HCl介質溶液中Eu3+與Que極易形成配位結構。

Eu3+ 與Que摩爾比，1～4：0、1∶3、2∶3、3∶3

Eu3+存在下Que的紅外光譜(圖6)中C=O振動峰、C-OH振動峰的消失均顯示有配位結構的形成，進一步證實了Eu3+-Que配合物的生成。Eu3+與Que的結合降低了溶液中Que的濃度，同時Eu3+-Que配合物有可能抑制Que與BSA的作用，從而使得Que與BSA的結合作用減弱。

圖6 Eu3+存在下Que的紅外光譜

3 結論

在模擬動物體生理條件下，運用熒光光譜、紫外吸收光譜、紅外光譜研究了Que與BSA的結合作用。結果表明，Que對BSA的熒光光譜具有猝滅作用，其猝滅機制為靜態猝滅，Eu3+的存在使得BSA發射峰藍移程度降低，猝滅常數、結合常數、結合位點數均減小，但沒有改變Que與BSA的作用機制。在較大濃度Eu3+存在下，Que與BSA結合作用的相關系數減小。分析認為，Eu3+與Que在與BSA結合上存在競爭作用，Eu3+與BSA有較強的靜電引力，過量的Eu3+分散在BSA外側，增大了Que與BSA之間的阻力，要發生同樣的反應吸收的熱量更多；另外，在Que結構中存在配位點，可與金屬離子形成穩定的配位結構，可能生成的Eu3+-Que配合物抑制了Que與BSA的結合。因此，Que與BSA的結合作用減弱是多種因素作用導致的。為研究Eu3+的生物醫學效應及Eu3+存在下Que的藥理、毒理作用提供了重要信息。

[1] Ercelen S，Klymchenko A S，Mely Y，et al.The binding of novel two-color fluorescence probe FA to serum albumins of different species[J].Int J Biol Macromol，2005，35(2)：231-242.

[2] 吳剛珂，顏承農.熒光光譜法研究吲哚美辛與牛血清白蛋白結合作用的熱力學特征[J].化學與生物工程，2009，26(9)：36-40.

[3] CAO Shu-hong，JIANG Xin-yu，CHEN Jing-wen.Effect of zinc(Ⅱ) on the interactions of bovine serum albumin with flavonols bearing different number of hydroxyl substituent on B-ring[J].Journal of Inorganic Biochemistry，2010，104(2)：146-152.

[4] 蔣新宇，李文秀，陳景文.鋅離子存在下槲皮素、楊梅素與牛血清白蛋白的結合[J].無機化學學報，2008，24(9)：1588-1595.

[5] 呂蔡，張杰.槲皮素的藥理作用[J].國外醫藥·植物藥分冊，2005，20(3)：108-112.

[6] Rawel H M,Meidtner K，Kroll J.Binding of selected phenolic compounds to proteins[J].J Agric Food Chem，2005，53(10)：4228-4235．

[7] 陳代武，謝青季，蔣雪琴，等.槲皮素與酪蛋白和牛血清白蛋白的相互作用及共存碳納米管的影響[J].物理化學學報，2008，24(3)：379-387.

[8] 王春，吳秋華，王志，等.槲皮素與牛血清白蛋白相互作用的研究[J].光譜學與光譜分析，2006，26(9)：1672-1675.

[9] 呂鑒泉，舒韻，周娟，等.熒光法研究鈣離子存在下槲皮素與牛血清白蛋白的相互作用[J].化學與生物工程，2010，27(7)：14-17.

[10] 倪嘉纘.稀土生物無機化學[M].北京：科學出版社，1995:172-197.

[11] 宋玉民，吳錦繡，鄭秀榮，等.稀土金屬離子與人血清白蛋白的相互作用[J].無機化學學報，2006，22(9)：1615-1622.

[12] Kandagal P B，Seetharamappa J，Shaikh S M T，et al.Binding of trazodone hydrochloride with human serum albumin：A spectroscopic study[J].Journal of Photochemistry and Photobiology A：Chemistry，2007，185(2/3)：239-244.

[13] 許金鉤，王尊本.熒光分析法[M].北京：科學出版社，2006：64-85.

[14] Ross P D，Subramanian S.Thermodynamics of protein association reactions：Forces contributing to stability[J].Biochemistry，1981，20(11)：3096-3102.