芪參益氣滴丸對糖尿病大鼠視網膜谷氨酸轉運體及谷氨酰胺合成酶表達的影響

鄧 輝 金 明 苑 維 潘 琳

高濃度谷氨酸（glutamate，Glu）的興奮性毒性是造成視網膜神經細胞損傷的一個重要因素。已有研究發現，糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）早期就有Glu循環障礙，導致細胞外Glu過量堆積，濃度升高，引起視網膜神經節細胞死亡〔1-2〕。視網膜Glu濃度的調節主要由Müller細胞通過谷氨酸轉運體（glutamate-aspartate transporters，GLAST）和谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）來完成，GLAST、GS功能及數量的減弱將導致其轉運Glu的能力下降。益氣活血類中藥（芪參益氣滴丸）對中樞神經、周圍神經具有神經營養因子樣作用，能增強膠質細胞的代償作用、促進損傷變性的神經細胞修復的作用〔3-5〕。本實驗通過觀察GLAST和GS在糖尿病大鼠視網膜表達的變化，探討芪參益氣滴丸對GLAST和GS表達的影響以及對視網膜神經細胞保護作用的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選用SPF級6周齡雄性SD大鼠40只，體重180～220克（購自維通利華實驗動物技術有限責任公司）。

1.2 實驗藥品及儀器

芪參益氣滴丸（天津天士力制藥股份有限公司，批號20050305）；羥苯磺酸鈣膠囊（西安利君制藥有限公司，批號 060118）；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）（Sigma公司）；兔抗人GLAST多抗、兔抗人GS多抗（abcam公司）；LSAB通用試劑盒（Dako公司）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（Dako 公司）；二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）（Sigma公司）；SAKURA CRM-440型病理切片機；SAKURA Tissue-Tek TECTM5 SM C1-042-SO型組織包埋機；Olympus BH-2光學顯微鏡；OLYMPUS BX-51數碼照相裝置；Image Plus Pro6.0圖象分析系統。

1.3 動物模型的制作

SD大鼠適應性飼養1周后，隨機選取10只為正常對照組（正常組），其余30只制作糖尿病大鼠模型。造模前大鼠禁食12小時，STZ在臨用時用無菌0.1 mmol/L，PH 4.4檸檬酸鈉緩沖液配成1%STZ溶液，按65 mg/Kg大鼠體重，左下腹腔內一次性注射，正常對照組注射同等體積的生理鹽水。72小時后取尾靜脈血，用快速血糖儀（Roche血糖儀，樂康全血糖檢測試紙）測量血糖。測血糖前8小時大鼠禁食。凡血糖≥16.7 mmol/L者即為糖尿病大鼠模型。

1.4 分組給藥

造模成功的糖尿病大鼠隨機分為糖尿病模型組（模型組）10只，芪參益氣滴丸治療組（治療組）10只，羥苯磺酸鈣膠囊治療組（對照組）10只。治療組和對照組大鼠在造模成功后次日開始給藥，每日上午灌胃給藥1次，分別給予芪參益氣滴丸、羥苯磺酸鈣膠囊的藥物溶液，劑量均為0.5 g/kg（正常成人劑量的20倍），芪參益氣滴丸、羥苯磺酸鈣膠囊用蒸餾水配成100 mg/ml的藥物溶液，每周配制1次，保存在4℃冰箱。正常組大鼠給予生理鹽水1 ml灌胃。實驗期間定期測量大鼠體重及血糖，實驗周期300 d。

1.5 制備視網膜切片

實驗結束后頸動脈放血處死大鼠，立即摘取眼球，置于 4%多聚甲醛（4℃，24 h）固定，沿角膜緣剪開眼球壁，去除角膜、晶狀體、玻璃體，余下的眼杯放入固定液中再固定48 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續切片（SAKURA CRM-440型病理切片機），切片厚度為 3μm。

1.6 GLAST、GS免疫組織化學染色

采用標記鏈霉親合素-生物素過氧化物酶法（labeled strepto-avidin-biotinperoxidase，LSAB）， 具體操作步驟如下：①石蠟切片脫蠟，梯度乙醇水化；②流水漂洗5 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗 5 min，2 次；③ 3%H2O2氧化 15 min，以消除內源性過氧化物酶，流水漂洗5 min，PBS洗5 min，2 次；④滴加 BSA（10%正常牛血清），室溫，濕盒孵育20 min；⑤在不同切片上，滴加一抗：兔抗人GLAST 多抗 1∶800 及兔抗人 GS 多抗 1∶50，4℃，濕盒孵育24 h，PBS洗5 min，3次；⑥滴加LSAB二抗，室溫，濕盒孵育90 min，PBS洗5 min，3次；⑦滴加LSAB三抗，室溫，濕盒孵育 90 min，PBS洗 5 min，3次；⑧DAB顯色3 min，流水洗5 min；⑨部分切片蘇木素復染30 s～1 min，未復染者作圖象分析用，流水洗3 min；⑩梯度酒精脫水，風干，二甲苯透明，中性樹脂封片。

所得切片在光學顯微鏡下觀察、拍照，未復染切片用Kodak公司的Image Plus Pro6.0圖象分析系統進行定量分析：每只大鼠取2張切片，每張切片在200倍下隨機選取10處視野，計算陽性表達的積分光密度（integrated optical density，IOD）值（細胞漿中棕黃色顆粒為陽性表達），IOD值=面積×平均光密度。

1.7 統計學處理

計數資料用均數±標準差表示，用SPSS 10.0軟件進行數據處理，均數間的兩兩比較采用q檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

GLAST、GS在各組大鼠視網膜各層組織中均有表達，其中以內顆粒層、神經節細胞層及內叢狀層著色反應最強，為深棕褐色，其余各層也可見絲條狀貫穿于內外界膜之間的陽性染色，模型組大鼠視網膜著色反應最弱（圖1～8）。Image Plus Pro6.0圖象分析顯示，治療組、模型組、對照組的視網膜GLAST、GS陽性表達IOD值低于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）；治療組 GLAST、GS 的 IOD 值明顯高于模型組和對照組（P＜0.05）（表 1）。

表1 各組大鼠視網膜中GLAST、GS陽性表達的IOD值（，n=10）

表1 各組大鼠視網膜中GLAST、GS陽性表達的IOD值（，n=10）

注：①與正常組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05，③與模型組比較，P＞0.05；④與對照組比較，P＜0.05。

組別 GLAST GS正常組 7.639±0.695 8.013±0.052治療組 6.820±0.404①②④ 6.532±0.073①②④模型組 5.491±0.121① 3.142±0.063①對照組 5.749±0.056①③ 4.743±0.232①②

3 討論

越來越多的研究表明，糖尿病患者的視網膜神經纖維功能改變，出現在可見的微血管改變之前〔6〕。因此除了視網膜微血管損害外，DR還是一種神經組織的慢性退行性病變，包括神經細胞凋亡增加、大膠質細胞反應性增生、小膠質細胞激活和谷氨酰胺（glutamine，Gln）代謝異常。這些變化可改變血管通透性，使過多的谷氨酸（glutamate，Glu）從血液中進入視網膜內，而Glu含量升高也可以誘發視網膜神經的退行性病變〔7〕。

Glu是視網膜最主要的興奮性神經遞質，光感受器、雙極細胞和神經節細胞都以Glu為遞質〔8〕，不同濃度的Glu代表不同的信號傳遞，高濃度的Glu具有興奮性毒性，其產生過多（或）清除減少是引起神經細胞死亡的重要機制。目前知道視網膜通過Glu-Gln循環來維持細胞外Glu濃度的穩定，以保持其正常的生理功能：首先，Müller細胞內合成的Glu在GS的作用下轉變為Gln，繼而被Müller細胞釋放到胞外，再被神經細胞攝取至胞內，在磷酸化的谷氨酰胺酶作用下，轉變為Glu，作為神經遞質釋放到突觸間隙，部分Glu與受體結合發揮作用，部分Glu通過Müller細胞胞膜上高親和力的GLAST結合轉運到Müller細胞內，進入下一個循環。在這個循環中，Müller細胞扮演著重要角色，它利用胞膜上的GLAST和胞內的GS對Glu進行轉運、降解（GS只存在于 Müller細胞內〔9〕），是視網膜內清除細胞外過量Glu的主要神經膠質細胞。GLAST、GS的功能和數量決定了Müller細胞對視網膜神經節細胞（retinal ganglion cells，RGCs）免受 Glu 毒性損害保護作用的強弱。

在DR時，Müller細胞調節細胞外Glu水平的能力受到損害，Müller細胞將Glu轉化為Gln的能力下降，造成視網膜內的Glu水平上升。

本實驗采用免疫組化LSAB法測量GLAST、GS在視網膜內的表達，結果糖尿病模型組大鼠視網膜細胞GLAST、GS陽性表達的IOD值較正常組明顯減少（P＜0.05），提示視網膜 Müller細胞胞膜 GLAST及胞內GS功能的改變可能是導致其轉運細胞外谷氨酸的能力受到破壞，使細胞外谷氨酸過量堆積，引起神經細胞死亡的原因。

芪參益氣滴丸由黃芪、丹參、三七及降香組成。現代藥理研究證實，黃芪可以減少自由基的過氧化反應，增強抗氧化酶的活性，提高動物的耐缺氧能力，減輕神經細胞的損害，促進損傷后神經功能的恢復；丹參素和丹參酮能增強視網膜血管及視神經纖維的耐缺氧能力，改善缺氧缺血損傷所致的線粒體氧化磷酸化功能障礙，調節細胞能量代謝，抑制神經細胞的凋亡，對神經細胞及其軸突具有保護作用；三七皂甙可抑制神經細胞的凋亡過程，對神經細胞損傷具有保護作用。我們在本實驗觀察到，芪參益氣滴丸治療組視網膜 Müller細胞GLAST、GS陽性表達IOD值較模型組明顯增強（P＜0.05），提示芪參益氣滴丸能夠促進Müller細胞GLAST及GS的表達，減輕DM對其功能和數量的影響，從而有效清除細胞外過量的Glu，減輕高濃度Glu的興奮性毒性作用，可對神經細胞起保護作用。

圖1 GLAST在正常組視網膜的表達。LSAB法×400，蘇木素復染。圖2 GLAST在模型組視網膜的表達。LSAB法×400，蘇木素復染。圖3 GLAST在治療組視網膜的表達。LSAB法×400，蘇木素復染。圖4 GLAST在對照組視網膜的表達。LSAB法×400，蘇木素復染。圖5 GS在正常組大鼠視網膜的表達。LSAB法×400，未復染。圖6 GS在模型組大鼠視網膜的表達。LSAB法×400，未復染。圖7 GS在治療組大鼠視網膜的表達。LSAB法×400，未復染。圖8 GS在對照組大鼠視網膜的表達。LSAB法×400，未復染。

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