慢病毒載體介導人非小細胞肺癌A549細胞Akt2基因靶向抑制

劉 丹 黃 燚 陳勃江 蒲 蓉 曾 靜 王 蕾 李為民

肺癌是一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，其中，約80% ～85%是非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。盡管肺癌治療已取得顯著的進步，但患者5年生存率仍無明顯改善［1］。因此探索肺癌發(fā)病機制，尋求新的治療靶點已成為當前的一項重要任務。

Akt信號通路作為潛在的腫瘤治療靶點，是目前腫瘤治療領域的研究熱點。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為信號通路的重要樞紐，它通過調(diào)節(jié)下游靶分子活性，參與多種細胞生物學功能，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展及血管的發(fā)生［2-3］。Akt共有三種亞型，包括Akt1、Akt2、Akt3。其中，Akt2是Akt的重要亞型，在許多腫瘤中都發(fā)現(xiàn)Akt2的基因擴增、蛋白有過度表達，然而Akt2在NSCLC中的作用尚存在爭議，其介導的特異性信號通路也未闡述清楚，相關研究報道較少［4-5］。本研究旨在采用慢病毒shRNA表達載體介導的RNA干擾技術，在NSCLC細胞株中靶向抑制Akt2基因表達，獲得穩(wěn)定干擾Akt2表達的NSCLC細胞株，為進一步探討Akt2在肺癌中的作用機制奠定研究基礎。

材料與方法

一、實驗材料

1.細胞株、菌株及病毒載體:人肺腺癌細胞株(A549)，293T細胞及大腸桿菌菌株DH5α均為本實驗室培養(yǎng)，慢病毒載體系統(tǒng)購自上海吉凱基因公司。

2.主要試劑:DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶及雙抗購自美國Hyclone公司，質(zhì)粒抽提試劑盒購自美國Qiagen公司，Age I及EcoRI內(nèi)切酶購自美國New England Biolabs公司，蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物公司，Akt2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司。

二、實驗方法

1.細胞培養(yǎng):A549及293T細胞以10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，在37℃、5%CO2、飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。貼壁生長的細胞2～3 d更換培養(yǎng)液一次，觀察細胞貼壁鋪滿培養(yǎng)皿70%～80%時可進行傳代。

2.制備特異性沉默Akt2的重組質(zhì)粒(pGCsil-shAkt2-GFP載體的構(gòu)建):根據(jù)RNA干擾設計序列原則及既往文獻報道，采用Invitrogen公司BLOCK-iT在線設計并進行評估測定(表1)，選擇最佳動力學參數(shù)靶點于上海吉凱基因公司合成含干擾序列的dsDNA oligo(表2)。把合成的引物干粉溶解于退火緩沖液中，經(jīng)Age I和EcoRI酶切pGCsil-GFP載體，以使其線性化。載體和dsDNA Oligo連接，于16℃連接過夜，干擾序列插入pGCsil-GFP質(zhì)粒，經(jīng)感受態(tài)細胞5DHα轉(zhuǎn)化、陽性克隆測序鑒定所插入的片段。PCR反應體系:Primer(+):5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’;Primer(-):5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’，pGCsil空載:306bp，陽性克隆:343bp。抽提重組質(zhì)粒及輔助包裝元件載體質(zhì)粒pHelper 1.0和p-Helper 2.0，通過陽離子脂質(zhì)體lipofectemin2000介導細胞轉(zhuǎn)染及慢病毒包裝，收集濃縮病毒，分裝、-80℃保存。

表1 Akt2 siRNA干擾序列設計信息Table 1 Information of Akt2 siRNA interference sequence

表2 干擾序列dsDNA oligo設計信息Table 2 Information of dsDNA oligo interference sequence

3.病毒滴度測定(孔稀釋法測定滴度):準備96孔板，以4×104細胞/孔密度鋪板，體積為100 μl。37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h，使細胞貼壁。準備7～10個無菌的EP管，倍比稀釋病毒原液，并以第一個EP管中的10 μl病毒原液記為1E+1 μl，第二個EP管中為第一個EP管的1/10，記為 1E+0 μl，第三個:1E-1μl…… 第七個:1E-5 μl，第八個:1E-6 μl。吸取96 孔板中待檢測細胞孔內(nèi)的90 μl培養(yǎng)基，丟棄。依次加入90 μl稀釋好的病毒溶液。將96孔板置入細胞孵箱培養(yǎng)24 h后，加入完全培養(yǎng)基100 μl，注意不要吹起細胞。繼續(xù)放入細胞孵箱培養(yǎng)。4 d后，觀察熒光表達情況，熒光細胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加而減少。根據(jù)公式:病毒滴度=感染熒光的細胞數(shù)/病毒原液量，計算病毒滴度。

4.shAkt2重組慢病毒感染靶細胞A549:將A549細胞按5×104/孔接種于6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至細胞融合度約達30%。根據(jù)預實驗感染條件摸索，A549細胞的MOI值為50，感染條件為完全培養(yǎng)基+5 μg/ml polybrene。根據(jù)MOI值加入適量病毒及polybrene，在水平方向輕輕拍打培養(yǎng)板，使培養(yǎng)基和病毒等試劑充分混勻，然后放入孵箱培養(yǎng)孵育。培養(yǎng)24 h后更換為含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。感染3 d后觀察慢病毒報告基因GFP的表達情況。

5.篩選穩(wěn)定表達shAkt2的細胞克隆:流式細胞分選具有分選精度高(99%以上)速度快的特點。成功感染shAkt2細胞同時表達報告基因GFP蛋白，以GFP為標記獲得高純度穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shAkt2的細胞克隆。根據(jù)BD FACSCalibur流式儀操作要求進行分選，將表達GFP強陽性細胞群分選至無菌離心管中。離心管內(nèi)的細胞懸液平分至培養(yǎng)皿中，37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)細胞。24 h后觀察細胞生長狀態(tài)及GFP表達情況。

6.熒光定量PCR檢測細胞Akt2的表達:細胞共分3組:正常對照(A549)組，陰性對照病毒(NC)組，Akt2干擾(shAkt2)組。抽提三組細胞的總RNA，根據(jù)Promega公司M-MLV操作說明書進行，總RNA經(jīng)70℃變性，0℃冰浴退火。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應1 h，獲得逆轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物-cDNA，取部分用于PCR，余保存在-80℃下。PCR引物信息如下:

Akt2:

上游引物:5’-GCGGAAGGAAGTCATCATTG-3’

下游引物:5’-GTGGGTCTGGAAGGCATAC-3’

設定程序為兩步法Real-Time PCR:經(jīng)變性、退火、延伸過程，并對數(shù)據(jù)進行Real time分析，分析采用 2-ΔΔCt分析法進行。

7.Western blot檢測Akt2的蛋白表達:根據(jù)凱基生物蛋白抽提試劑盒操作說明抽提細胞蛋白。并采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法測定總蛋白含量，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，80～100 V電泳1～2 h后，采用濕轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)膜，用封閉液(含5%脫脂牛奶的TBST溶液)，室溫、搖床上封閉PVDF膜2 h。4℃孵育過夜。第2天，TBST洗膜5 min×3次。室溫孵育二抗(1︰1000)及內(nèi)參GAPDH(1︰5000)1 h。Millipore公司 Luminata Crescendo Western HRP substrate顯色液孵育3 min，Molecular Image ChemiDoc XRS System(Bio-Rad)曝光5 s～10 min。Quantity one分析軟件測定條帶灰度。

8.統(tǒng)計學分析:用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)表示為，采用方差分析(analysis of variance，ANOVA)，最小顯著差(least-significant difference，LSD)法兩兩比較。P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、重組pGCsil-shAkt2-GFP質(zhì)粒的鑒定

1.陽性克隆的PCR鑒定:pGCsil-shAkt2-GFP連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)，挑選出的陽性克隆溶于LB培養(yǎng)基，作為菌落PCR模板。PCR凝膠電泳圖如圖1，以dd H2O(1泳道)為陰性對照，排除系統(tǒng)中外源核酸污染導致的假陽性結(jié)果，Maker指示PCR產(chǎn)物的片段大小(3泳道)，結(jié)果顯示，陽性克隆組(4-7組)PCR產(chǎn)物條帶大小約為343bp(從載體中切出24bp)，大于空載體自連對照組(2泳道)(片段大小約306bp)，說明陽性克隆已插入外源片段，需進一步測序驗證。

圖1 pGCsil-shAkt2-GFP質(zhì)粒菌落PCR電泳圖Figure 1 PCR electrophoretogram of pGCsil-shAkt2-GFP plasmid

2.重組質(zhì)粒的測序:挑選重組質(zhì)粒陽性克隆送至Invitrogen公司測序。測序報告見圖2，結(jié)果顯示:陽性克隆序列內(nèi)含有干擾Akt2的shRNA片段序列，片段序列為:

CcggGCACAGGTTCTTCCTCAGCTTCAAGAGAGCTGAGGAAGAACCTGTGCTTTTTg，片段大小為57 bp，與之前所設計的針對Akt2的shRNA片段序列完全符合。證明shAkt2序列已成功克隆到慢病毒pGCsil-GFP載體中。

圖2 重組pGCsil-shAkt2-GFP質(zhì)粒測序鑒定Figure 2 Sequence of recombinant pGCsill-shAkt2-GFP plasmid

二、shAkt2慢病毒表達載體的滴度測定

逐孔稀釋法測定病毒滴度，病毒原液經(jīng)倍比稀釋感染293T細胞，培養(yǎng)4 d后，觀察細胞熒光表達情況。以病毒原液記為1E+1μl，遞次稀釋十倍，依次類推稀釋病毒記為1E+0μl，1E-1μl，1E-2μl……1E-6μl。根據(jù)細胞熒光表達情況如圖3所示，在加入1E-6μl病毒原液的孔中觀察到3個帶有熒光的細胞，則本實驗獲得重組Akt2-shRNA慢病毒滴度為:3/(1E-6)=3E+6 TU/μl，即3E+9 TU/ml，滿足實驗需要。

三、穩(wěn)定干擾Akt2基因細胞克隆的篩選

1.重組慢病毒shAkt2感染A549細胞:將重組慢病毒shAkt2和NC對照病毒同時感染人肺腺癌細胞株A549，24 h后更換為完全培養(yǎng)基，觀察細胞熒光表達情況。5 d后，A549細胞感染效率達80%以上，感染后細胞狀態(tài)良好(圖4)。

圖3 重組shAkt2慢病毒滴度測定Figure 3 Lentivirus titer of recombinant shAkt2

圖4 各組細胞病毒感染率及GFP熒光表達水平Figure 4 Virus infection，and GFP expression in cells

2.流式分選篩選穩(wěn)定干擾Akt2的細胞克隆:成功感染shAkt2細胞同時表達基因GFP蛋白，以GFP為標記，經(jīng)流式細胞儀分選GFP強陽性細胞，占細胞總數(shù)的90.1%(圖5)，獲得穩(wěn)定沉默Akt2基因的細胞克隆。

圖5 流式細胞分選表達GFP強陽性的shAkt2細胞Figure 5 GFP Strong positive shAkz cells obtained by flow cytometer

四、Akt2基因干擾效果的驗證

1.熒光定量PCR檢測Akt2 mRNA的表達水平:抽提A549、NC及純化后shAkt2細胞組細胞的總RNA，采用β-actin作為內(nèi)參，2-ΔΔCt分析法分析Akt2 mRNA含量，方差統(tǒng)計分析結(jié)果示，陰性對照組與未感染病毒A549細胞mRNA水平無明顯變化，而shAkt2細胞組與A549及NC組比較，Akt2 mRNA明顯抑制(P=0.001和 P=0.002，圖6)，與正常組相比，抑制率約為 63.39%，提示shAkt2細胞克隆顯著干擾Akt2 mRNA的表達。

圖6 各組細胞中Akt2 mRNA的表達水平Figure 6 Akt2 mRNA expression in A549，NC and shAkt2

2.Western blot檢測Akt2的蛋白表達水平:未感染病毒A549細胞、NC陰性對照組和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shAkt2細胞組抽提總蛋白，以β-actin為內(nèi)參，進行western blot檢測，統(tǒng)計各組條帶灰度值，比較Akt2蛋白在各組細胞中的表達水平。如圖7所示，shAkt2細胞組中Akt2的蛋白表達較其他兩組明顯抑制(P＜0.01)，與正常對照組A549相比，蛋白表達量抑制率為91.56%，說明shAkt2組細胞Akt2蛋白表達獲得穩(wěn)定抑制。

圖7 A549、NC及shAkt2組細胞Akt2蛋白表達水平的比較Figure 7 Comparison of Akt2 protein expression in A549，NC and shAkt2

討 論

Akt2基因是Akt家族的重要亞型，負責編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，定位于人類染色體的19q13.1-q13.2。已證實Akt2作為癌基因參與了多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，并介導腫瘤細胞生長、黏附、運動、侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究擬通過制備有效的靶向干擾Akt2基因的重組慢病毒載體，感染肺腺癌細胞株A549，并檢測其對A549細胞的Akt2基因的沉默效率，建立穩(wěn)定干擾Akt2基因的細胞克隆，為后續(xù)研究Akt2在NSCLC中的作用奠定基礎。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術是由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘導同源靶基因mRNA特異性降解，從而特異性抑制目的蛋白的表達，導致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象［6］。由于其具有高度靶向性和高效性等特點，成為腫瘤研究領域的重要方法，廣泛應用于基因功能、干細胞發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導及抗腫瘤治療等多學科領域。

在細胞內(nèi)，dsRNA分子被胞內(nèi)RNA酶Dicer降解為大小約21～23個堿基的小片段RNA，即siRNA，隨之，siRNA在RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，其中，反義siRNA與體內(nèi)的內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等結(jié)合形成 RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)［7-8］。RISC具有核酸酶功能，能夠與外源性基因表達的mRNA在同源區(qū)內(nèi)進行特異性的結(jié)合，并在此結(jié)合部位切割降解mRNA，誘發(fā)宿主細胞產(chǎn)生針對這些mRNA的降解反應。同時，在RNA聚合酶作用下，以siRNA為引物與靶RNA結(jié)合從而合成大量的dsRNA，使RNAi作用進一步放大，最終促使靶mRNA完全降解［6，9-10］。RNAi具有高效、特異的靶向沉默基因的作用，目前已經(jīng)成為基因治療和基因功能研究的重要工具。

目前RNAi的制備方法主要包括化學合成、體外轉(zhuǎn)錄、體內(nèi)表達。盡管化學合成的siRNA能特異性抑制細胞內(nèi)同源基因的表達，但在細胞內(nèi)容易降解，穩(wěn)定性差，而將小發(fā)卡RNA(small hairpin RNA)導入細胞后，能在細胞內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄生成shRNA，并進一步加工成靶基因特異性siRNA，從而發(fā)揮穩(wěn)定、長期抑制靶基因的表達作用［11-12］。然而，一般的shRNA盡管能夠轉(zhuǎn)染到分裂細胞中，但是很難導入到非分裂細胞、原代細胞及人或動物體內(nèi)去。因此，利用病毒載體包括慢病毒及腺病毒等，因其操作方便、轉(zhuǎn)染效率高及穩(wěn)定性表達等而被廣泛應用。使用腺病毒載體感染細胞時，病毒DNA游離在細胞核內(nèi)，不能整合到染色體上，在體內(nèi)不能實現(xiàn)穩(wěn)定長期表達，并且容易引起免疫反應［13-15］。慢病毒載體是以人類免疫缺陷型病毒(human immunodeficiency virus，HIV)為基礎發(fā)展起來的基因治療載體，既能夠感染分裂細胞，而且可以感染非分裂細胞，尤其是攜帶shRNA的慢病毒載體，不僅能夠廣泛的感染宿主細胞，而且也能夠穩(wěn)定整合于靶細胞的基因組內(nèi)，具有表達時間長、靶向性佳，不易誘發(fā)宿主免疫反應、安全性好等優(yōu)點。因此，表達shRNA的慢病毒載體已廣泛應用于多種細胞內(nèi)基因功能的研究［16］。

本研究所使用的慢病毒載體系統(tǒng)由pGCsil-LV載體、p-Helper 1.0載體和p-Helper 2.0載體組成。pGC-LV載體中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他輔助元件，例如WRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。根據(jù)不同的實驗目的針對pGC-LV載體改造以進行啟動子活性研究、基因表達研究、RNAi等研究。pHelper 1.0載體中含有HIV病毒的gag基因，編碼病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白;pol基因，編碼病毒特異性的酶;rev基因，編碼調(diào)節(jié)gag和pol基因表達的調(diào)節(jié)因子。pHelper 2.0載體中含有單純皰疹病毒來源的VSV-G基因，提供病毒包裝所需要的包膜蛋白。

本研究根據(jù)RNAi干擾原理，針對Akt2設計干擾序列，并合成其寡核苷酸，連接至已線性化的慢病毒pGCsil-LV載體U6啟動子下游，在大腸桿菌H5α內(nèi)同源重組，經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切和測序，證實重組成功后，轉(zhuǎn)入哺乳動物細胞，載體表達出shRNA，這種shRNA很快在細胞中加工成為21～23個堿基大小的dsRNA分子，隨后啟動RNAi過程。同時質(zhì)粒攜帶GFP序列，用于判讀轉(zhuǎn)染效果并篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。經(jīng)進一步采用熒光定量PCR及western-blot檢測Akt2基因表達水平。結(jié)果顯示，實驗組Akt2 mRNA水平較對照組下降大于63.39%，而蛋白水平減少91.56%，說明本研究構(gòu)建的慢病毒shRNA表達載體在A549細胞內(nèi)能持續(xù)、特異、高效的抑制Akt2基因表達，為后續(xù)研究奠定了技術基礎，也為腫瘤基因靶向沉默治療帶來了新希望。

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