人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及個(gè)體化藥敏實(shí)驗(yàn)研究

劉 浩 洪志鵬 尹小川 唐睿珠 郝 萍

肺癌(lung cancer)是人類最常見的惡性腫瘤之一。其中，80%的肺癌是非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，而1/3的NSCLC病人就診時(shí)已屬晚期(Ⅲ、Ⅳ期)，近年來NSCLC的發(fā)病率持續(xù)升高，尤其是非吸煙人群中的婦女，其肺腺癌的發(fā)病率及細(xì)支氣管肺泡癌的發(fā)病率令人擔(dān)憂，其分子流行病學(xué)的原因尚未清楚，因此目前更加令人關(guān)注的是對NSCLC的治療。其中，化療在晚期NSCLC治療中起著重要作用。如何選擇對NSCLC有效的化療藥物，提高術(shù)后化療效果，并尋找用藥規(guī)律，一直是臨床腫瘤化療關(guān)注的問題。個(gè)體化化療是21世紀(jì)胸外科臨床發(fā)展的方向和理想的治療模式。我們采用MTT法對30例NSCLC進(jìn)行體外原代細(xì)胞培養(yǎng)和藥物持續(xù)作用觀察，檢測其對5種化療藥物(長春瑞濱、依托泊苷、長春新堿、吉西他濱、多西他賽)的敏感性，并進(jìn)行比較，希望能通過本課題的研究為肺癌個(gè)體化化療敏感藥物的選擇提供參考。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.肺癌細(xì)胞

30例手術(shù)標(biāo)本來自昆明醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院胸外科，病理確診為NSCLC。肺腺癌14例、肺鱗癌16例。其中，男性患者17例，女性患者13例，年齡36～68.歲，平均年齡51歲。

2.化療藥物

我們結(jié)合當(dāng)前實(shí)際及常用化療方案從中選用五種化療藥，四種一線藥物長春瑞濱(NVP)、依托泊苷(VP-16)、長春新堿(VCR)、吉西他濱(GEM)以及一種二線藥物多西他賽(TAX)。試驗(yàn)藥物濃度即峰濃度(μg/mL)=(mg×平均體表面積/平均體重)×(100/60)其中mg為臨床用藥劑量(mg.kg-1.d-1)，國內(nèi)大多數(shù)教科書介紹體表面積的計(jì)算公式是:

SA=0.035W+0.1(W≤30)

1.05+(W-30)×0.02(W ＞30)

SA為人體表面積(m2);W為體重(kg);按照平均體重60 kg計(jì)算，平均體表面積為1.65。化療藥物配制濃度及產(chǎn)地，見表1。

表1 化療藥物配制濃度及產(chǎn)地Table 1 Confected concentration and origin of chemotherapeutics

3.主要試劑與儀器

RPMI-1640(美國Gibco公司);胰蛋白酶(美國Amresco公司);淋巴細(xì)胞分離液:(天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司);小牛血清:(杭州四季青生物工程材料有限公司);MTT(四甲基氮唑藍(lán)):(美國Amresco公司);DMSO:二甲基亞砜，分析純(美國Sigma公司);離心機(jī)(LXJ-II，TGL-16B，上海醫(yī)用分析儀器廠);超低溫冰箱(KK24E18TI，SIEMENS);電子天平(BP121S，Sartorius);CO2培養(yǎng)箱(HF240，Shanghai Lishen Scientific Equipment CO.Ltd);倒置光學(xué)顯微鏡(南京江南永新光學(xué)有限公司);96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar公司);酶聯(lián)免疫檢測儀((SYNTRON-MPR-2100，Thermo Labsystem公司);電熱恒溫水溫箱(上海醫(yī)療器械七廠);蠕動(dòng)泵(MILLPORE公司);微量振蕩器(MH-1型，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

二、研究方法

1.制備單細(xì)胞懸液

取手術(shù)切除的新鮮癌組織約1.0 cm3大小，選取無壞死部分，盡量剔除纖維組織及黑色顆粒，立即浸入無菌培養(yǎng)瓶中，盡可能短時(shí)間(10 min內(nèi))轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。在超凈臺(tái)上，用無菌PBS液沖洗2次，無菌切除組織包膜，結(jié)締組織與壞死組織，剪成盡可能小的組織碎塊，大小約1 mm3。將組織小塊置于0.25%胰酶40 mL中，裝入培養(yǎng)瓶，置于37℃水浴箱中30 min，并不時(shí)搖動(dòng)，使其充分消化，期間在鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓接近脫壁時(shí)，棄消化液，用10 mL完全－1640終止消化。用200目篩網(wǎng)將消化后的細(xì)胞懸液過濾收集，用無菌PBS液洗滌2次(離心，1500 r/min)，懸于20 mL完全-1640中，鏡下觀察細(xì)胞。于無菌離心管中依次輕輕加入100%及60%的淋巴細(xì)胞分離液各10 mL，其上再沿管壁輕輕加入細(xì)胞懸液(離心，2000 r/min，20 min)，收集60%分離液界面上的細(xì)胞，加5倍無菌PBS液(離心，2000 r/min，20 min)，去上清，加15 mL無菌PBS液，離心前進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，再次離心，2000 r/min，20 min，去上清，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL ～2×105/mL。

2.實(shí)驗(yàn)方法

種96孔板，分設(shè)加藥孔，陰性對照孔，空白孔，設(shè)3復(fù)孔。加藥孔與陰性對照孔，每孔100 μL細(xì)胞懸液，空白孔每孔100 μL完全 －1640，最后每孔補(bǔ)加100 μL完全 －1640，每孔終體積為200 μL。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。加化療藥，加藥孔加20 μL化療藥，陰性對照孔加20 μL完全－1640，空白孔加20 μL完全－1640。將96孔培養(yǎng)板密封后繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察48 h。每孔加入5 mg/mL的MTT20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去上清后，每孔加入二甲基亞砜150 μL，混勻，振蕩培養(yǎng)板10 min，使孔中沉淀完全溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀上，以空白孔較0，以490 nm為測量波長，690 nm為參考波長，測每孔吸光度值(A值)。

計(jì)算活性抑制率:活性抑制率=(陰性對照組A值-加藥組A值)/陰性對照組A值×100%。當(dāng)加藥組血漿高峰濃度水平時(shí)的抑制率大于50%時(shí)，即為高敏，小于30%為耐藥，介于兩者之間為中敏。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件處理分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)行×列表資料χ2檢驗(yàn)，組間比較用四格表的確切概率法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

本實(shí)驗(yàn)對30例非小細(xì)胞肺癌患者的癌細(xì)胞進(jìn)行了體外藥物敏感性測定，結(jié)合當(dāng)前臨床實(shí)際選用了5種化療藥，每種化療藥對非小細(xì)胞肺癌抑制率順序依次為TAX＞GEM＞NVB＞VP-16＞VCR(表2)，其總敏感率分別為100%、99%、62%、51%、32%，而高度敏感的敏感率分別為72%、63%、39%、35%、20%(表3)，提示肺癌對上述5種藥物均敏感。采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)行×列表資料的χ2檢驗(yàn)分析表3，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用四格表的確切概率法進(jìn)行兩兩比較，TAX和GEM治療NSCLC的有效率基本相同，可做為首選;而NVB、VP-16、VCR三藥兩兩比較，NVB與VP-16的有效率基本相同，VP-16與VCR的有效率基本相同，其中NVP的有效率高于VCR，VCR的高度敏感率不足30%，提示VCR治療效果差，。故治療NSCLC時(shí)應(yīng)首選TAX和GEM與鉑類藥物組合。五種化療藥對NSCLC的抑制率比較及治療NSCLC的敏感性比較分別見表2和表3。

討 論

肺癌是全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，約占所有腫瘤的12.4%，且發(fā)病率一直呈上升趨勢。近年來，雖然醫(yī)療診治水平有了較大的提升，但5年生存率仍不高［1］。中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生信息中心公布，在21世紀(jì)，肺癌將成為中國居民的主要死因，肺癌將主導(dǎo)中國癌癥流行趨勢。而云南作為我國農(nóng)民肺癌高發(fā)地區(qū)，尤其女性肺癌病死率居全國首位，對肺癌的綜合治療顯得尤為重要。

臨床對肺癌的化療多憑經(jīng)驗(yàn)給藥，而公式化的治療往往具有盲目性，造成多藥耐藥，不良反應(yīng)大，療效不佳的效果。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)［2］，用藥敏試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥治療的有效率要明顯高于不做藥敏試驗(yàn)，憑經(jīng)驗(yàn)給藥的對照組。

為進(jìn)行NSCLC的個(gè)體化藥敏實(shí)驗(yàn)研究，我們選擇了NSCLC細(xì)胞的原代培養(yǎng)，通過該方法獲得NSCLC細(xì)胞。這是本實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。我們總結(jié)幾點(diǎn)主要注意事項(xiàng)如下:①病例入選標(biāo)準(zhǔn)為患者年齡越小越好，最好選擇60歲以下的患者，以保證細(xì)胞的活力;盡可能地選擇無其他合并疾病特別是傳染病的患者，將細(xì)胞的污染機(jī)會(huì)降到最低;取材時(shí)應(yīng)保證無菌，避開纖維組織和壞死部位，如果腫瘤較大，最好取腫瘤的外周部分;②實(shí)驗(yàn)前做到杜絕一切可能的污染是成功的關(guān)鍵;③取材后最好在30 min內(nèi)(最佳為10 min)送到實(shí)驗(yàn)室開始實(shí)驗(yàn)，這樣可以最大限度保證細(xì)胞的活力和數(shù)量;④腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)方法我們選擇酶消化法，該種方法可以將妨礙細(xì)胞生長的細(xì)胞間質(zhì)包括基質(zhì)、纖維等去除，使細(xì)胞分散，形成懸液，易于從外界吸收養(yǎng)分和排除代謝產(chǎn)物，可以很快得到大量活細(xì)胞，細(xì)胞也可能在短時(shí)間內(nèi)生長成片。同時(shí)我們采用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離純化肺癌細(xì)胞懸液，有文獻(xiàn)［3］證明采用梯度離心法收集純化癌細(xì)胞后再行MTT藥敏試驗(yàn)，比傳統(tǒng)的方法藥敏陽性率有顯著提高(P＜0.01)，實(shí)驗(yàn)收到了預(yù)期的效果。

20世紀(jì)80年代中期開始MTT法藥敏試驗(yàn)首先應(yīng)用于急性白血病的治療中，指導(dǎo)臨床用藥，取得了良好的相關(guān)性和療效［4］。目前已逐步應(yīng)用到肺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌等實(shí)體腫瘤的治療中，結(jié)果提高了藥物的選擇性，提高了化療質(zhì)量和化療個(gè)體化效果［5-8］。目前，該方法已廣泛應(yīng)用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測定等。MTT法的特點(diǎn)是靈敏度高、重復(fù)性好、經(jīng)濟(jì)、快速、易自動(dòng)化、無放射性污染、與其他體外藥物敏感試驗(yàn)方法(如細(xì)胞計(jì)數(shù)法、軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)和3H-TdR摻入試驗(yàn)等)相比操作較簡單、實(shí)驗(yàn)誤差減少，并且與臨床化療療效有較好的一致性［9］，利于臨床應(yīng)用，但尚存一些不足，有待克服。

表2 五種化療藥對NSCLC的抑制率比較Table 2 Comparison of inhibition ratio of five chemotherapeutics on NSCLC

表3 五種化療藥治療NSCLC的敏感性比較Table 3 Comparison of sensitivity among five chemotherapy agents on the treatment of NSCLC

腫瘤是一個(gè)異質(zhì)性、多形態(tài)、分化程度不等的細(xì)胞群體。腫瘤對各種化療藥物的敏感性存在著明顯個(gè)體差異。即不同的腫瘤類型或同一類型的不同病人，甚至同一病人在不同的發(fā)病階段，對化療的敏感性并不完全相同，治療效果差別也很大。至今還沒有一種化療藥物或幾種化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用，能對某一種腫瘤 100% 有效［10，11］。

綜上所述，本課題之肺癌細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法可獲得藥敏實(shí)驗(yàn)所需的肺癌細(xì)胞。MTT法在原代肺癌細(xì)胞藥物敏感性試驗(yàn)研究中值得推廣，可在基層醫(yī)院普及。30例非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對多西他賽與吉西他濱最敏感，可作為臨床治療NSCLC首選之一，該實(shí)驗(yàn)方法也可作為NSCLC個(gè)體化治療的選擇之一。通過本課題的研究能為臨床NSCLC個(gè)體化化療提供參考。

1 Parking M，Bray F，F(xiàn)erlay J，et al.Global cancer statistics，2002［J］.CA Cancer J Clin，2005，55(2):74-108.

2 高 隆，霍潤輝.肺癌體外藥敏試驗(yàn)與臨床療效的相關(guān)性［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24(23):2203-2204.GAO Long，HUO Run-hui.The relevance between fungi susceptibility test in vitro and treatment response of lung cancer［J］.J Four Milit Med Univ，2003，24(23):2203-2204.

3 謝曉東，李小民，蔣 芹，等.改良MTT法原代癌細(xì)胞培養(yǎng)藥物敏感性試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.陜西腫瘤醫(yī)學(xué)，2001，9(4):230-232.XIE Xiao-dong，LI Xiao-min，JIANG Qin，et al.Experimental Study on the cancer cell primary culture fungal susceptibility test of improved MTT method［J］.Shanxi Oncol Med，2001，9(4):230-232.

4 賈慶瑞.MTT比色分析法在白血病細(xì)胞藥物敏感性測定中的應(yīng)用［J］.腫瘤防治研究，1992，19(3):163-164.JIA Qing-rui.The application of Method MTT colorimetric assay on leukemia cell fungal susceptibility test［J］.Cancer Res Prev Treat，1992，19(3):163-164.

5 Kusumoto T，Sakaguchi Y，Machara Y，et al.Comparisgn of in vitro anticancer chemosensitivity between human squamous cell carcinoma and adenocarcinoma［J］.Oncology，1992，49(5):343-346.

6 Yamaue H，Tanimura H，Tsunoda T，et al.Chemosensitivity testing with highly purified fresh human tumour cells with the MTT colormetric assay［J］.Eur J Cancer Chin Oncol，1991，27(10):1258-1263.

7 張翠卿，唐東平，佐傳田，等.MTT法在非小細(xì)胞肺癌優(yōu)化治療方案中的應(yīng)用［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2007，15(11):1566-1568.ZHANG Cui-qing，TANG Dong-ping，ZUO Chuan-tian，et al.The application of MTT method on optimize therapeutic scheme of non-small cell lung cancer［J］.Mod Oncol，2007，15(11):1566-1568.

8 辛華雯，王潤幫.MTT法在惡性腫瘤體外藥物敏感試驗(yàn)中的臨床應(yīng)用［J］.實(shí)用癌癥雜志，1994，9(2):73-75.XIN Hua-wen，WANG Run-bang.The clinical application of MTT method on fungi susceptibility test in vitro of malignant tumour［J］.Pract J Cancer，1994，9(2):73-75.

9 Sargent JM.The use of the MTT assay to study drug resistance in fresh tumour samp les［J］.Recent Results Cancer Res，2003，161:13-25.

10 張銀霞.腫瘤藥敏試驗(yàn)方法及臨床應(yīng)用［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2003，9(1):34-35.ZHANG Yin-xia.The method and clinical application of tumor fungi susceptibility test in vitro［J］.Med Recapit，2003，9(1):34-35.

11 劉 敏，呂 鵬，于志紅，等.消化道癌原代培養(yǎng)體外藥敏實(shí)驗(yàn)的研究［J］.中國微生態(tài)，2006，18(6):468-470.LIU Min，LV Peng，YU Zhi-hong，et al.The inhibitory effect of chemotherapy on digestive tract carcinomas［J］.Chin J Microecol，2006，18(6):468-470.