松茸多糖超聲提取物抗氧化活性研究

張 婭,李寶才,項朋志,高云濤

(1.昆明理工大學生命科學與技術學院,云南 昆明 650093；2.云南省中醫中藥研究院，云南 昆明 650223；3.云南國防工業職業技術學院，云南 昆明 650223；4.國家民委-教育部共建民族藥資源化學重點實驗室，云南 昆明 650500)

松茸(Tricholomamatsutake)在真菌分類上屬擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、蘑菇科、蘑菇屬，原產于巴西，又名“巴西蘑菇”[1]。多糖是松茸的重要活性成分[2～4]，大量藥理及臨床研究證實，多糖有調節免疫、抗癌、抗肥胖、控制血糖、降膽固醇、降血脂等生理功能，作為綠色生物醫藥產品具有廣闊的市場前景[5]。研究表明，松茸多糖的抗腫瘤活性遠遠高于靈芝，在被研究的15種具有抗癌活性的食用菌中位居首位[6]。

作者采用超聲波輔助水提[7]、分級醇沉純化[8]的方法制得松茸多糖，對松茸多糖抗氧化活性進行測定并與茶多酚進行比較，擬為松茸的開發利用提供科學依據。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

松茸為鮮品，采自云南麗江。

核黃素(VB2)、氯化硝基四氮唑蘭(NBT)，ChemBase公司；番紅花紅(Safranine T)，蛋氨酸，2-硫代巴比妥酸(TBA)，三氯乙酸(TCA)，苯酚，葡萄糖，磷酸鹽(PBS)緩沖溶液，茶多酚(97%)。所用試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

7200型可見分光光度計，尤尼柯上海儀器有限公司；AS3120A型超聲波清洗器，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；植物粉碎機；光照箱(35 cm×30 cm×25 cm，光源為純稀土節能燈，燈功率2×18 W)，自制。

1.2 松茸多糖的提取

采用超聲波輔助水提、分級醇沉純化的方法提取松茸多糖，流程如下：

松茸洗凈→稱重→粉碎→超聲提取→抽濾除渣→減壓濃縮→乙醇沉淀→真空干燥→粗多糖→復溶→脫蛋白→離心分離→乙醇沉淀→真空干燥→精制多糖

1.2.1 樣品處理

松茸洗凈，晾干，稱重，用植物粉碎機粉碎至勻漿狀。

1.2.2 超聲提取

松茸漿置于500 mL錐形瓶中加入250 mL蒸餾水，置于超聲波清洗器中浸提30 min,減壓抽濾,濾渣在相同條件下重復浸提3次，合并濾液，在真空旋轉蒸發器中濃縮。

1.2.3 多糖精制

向濃縮后的多糖溶液中加入3 BV 95%乙醇,經抽濾、真空干燥后得粗多糖。

粗多糖加蒸餾水復溶后用Sevag試劑(氯仿∶正丁醇=5∶1)除蛋白,連續操作多次,直到完全脫除蛋白為止[6]。

向脫蛋白后的多糖溶液中加入3 BV 95%乙醇,沉淀用乙醇、丙酮及乙醚反復洗滌,經抽濾、在超低溫冰箱中2次凍干后得到精制松茸多糖提取物，置于棕色瓶中，于4 ℃保存。

1.3 多糖含量的測定

多糖含量的測定采用硫酸-苯酚法[9]。

標準曲線的繪制：取葡萄糖于105 ℃干燥至恒重,精確稱取20.0 mg,加蒸餾水溶解,定容至500.0 mL，得葡萄糖標準溶液。分別吸取0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、 1.0 mL、 1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL的葡萄糖標準溶液,置于10.0 mL試管中，加水補足至2.0 mL,加入6%苯酚1.0 mL,搖勻,迅速滴加濃硫酸5.0 mL,室溫放置5 min,置沸水浴中加熱20 min,迅速冷卻至室溫,于490 nm處測吸光度。以蒸餾水為空白。以葡萄糖濃度c(mg·mL-1)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標,繪制標準曲線，擬合線性回歸方程為：A=7.7391c-0.0039(R=0.99967)。

取1.0 mL多糖溶液，依標準曲線的方法測定樣品中多糖含量。

1.4 抗氧化活性的測定

1.4.1 多糖溶液的配制

稱取精制多糖，臨用前用蒸餾水配制成100 mg·mL-1溶液，并稀釋至不同濃度進行抗氧化實驗。

1.4.2 超氧陰離子自由基的產生及清除活性測定

采用光照核黃素法[10～12]產生超氧陰離子自由基。用0.05 mol·L-1pH值7.4的PBS緩沖溶液，配制1.67 ×10-5mol·L-1核黃素、0.01 mol·L-1蛋氨酸、9.2×10-5mol·L-1松茸多糖提取液(樣品)或茶多酚溶液(對照)各1.0 mL，置于光照箱中光照30 min，取出后以緩沖溶液為參比于560 nm處測定溶液的吸光度。空白管以1.0 mL緩沖溶液代替樣品溶液。按式(1)計算超氧陰離子自由基清除率：

(1)

式中：A0為空白管的吸光度；A樣為樣品管的吸光度。

1.4.3 羥基自由基的產生及清除活性測定

采用Fenton反應產生羥基自由基，產生的羥基自由基可使番紅花紅褪色[10～12]，計算松茸多糖提取液對羥基自由基的清除能力。

取0.15 mol·L-1pH值7.4的PBS緩沖溶液、40 μg·mL-1番紅花紅、0.945 mmol·L-1EDTA-Fe(Ⅱ)(新鮮配制)各1.0 mL、不同濃度的松茸多糖溶液或茶多酚溶液0.5 mL、3%H2O2(新鮮配制)1.0 mL，混勻后于37 ℃水浴中反應30 min，于520 nm處測定吸光度(As)。空白組以0.5 mL蒸餾水代替樣品溶液測定吸光度(Ac)，對照組以1.5 mL蒸餾水代替H2O2和樣品溶液測定吸光度(A)，用3.5 mL蒸餾水代替番紅花紅、EDTA-Fe(Ⅱ)、H2O2、樣品溶液，用1.0 mLPBS緩沖溶液調零。按式(2)計算羥基自由基清除率：

(2)

1.4.4 脂質過氧化抑制活性的測定

(3)

2 結果與討論

2.1 松茸多糖的提取率

利用超聲波輔助水提及醇沉法從松茸中提取可溶性多糖,多糖提取率達到5.10%，提取物中多糖含量為54.32%。

2.2 對超氧陰離子自由基的清除作用

松茸多糖對光照核黃素產生超氧陰離子自由基的清除作用見圖1。

圖1 松茸多糖對超氧陰離子自由基的清除作用

由圖1可知，隨著濃度的增加，超氧陰離子自由基的清除率均增大，茶多酚產生清除作用的濃度略低于松茸多糖。松茸多糖對超氧陰離子自由基清除作用的IC50為0.32 mg·mL-1，茶多酚對超氧陰離子自由基清除作用的IC50為0.23 mg·mL-1，說明茶多酚對超氧陰離子自由基的清除啟動較快；當二者的濃度≥0.7 mg·mL-1時，松茸多糖的最大清除率為76.2%、茶多酚的最大清除率為78.2%，這表明濃度較高時松茸多糖與茶多酚對超氧陰離子自由基的清除作用比較相近。最大清除作用與茶多酚相近、IC50卻較高的原因是松茸多糖的有效成分含量(54.32%)低于茶多酚(97%)。

2.3 對羥基自由基的清除作用

松茸多糖對Fenton反應產生羥基自由基的清除作用見圖2。

圖2 松茸多糖對羥基自由基的清除作用

由圖2可知，松茸多糖對羥基自由基清除作用的IC50為0.47 mg·mL-1，茶多酚的IC50為0.32 mg·mL-1；當松茸多糖的濃度≥0.8 mg·mL-1時，對羥基自由基的清除效果較好，最大清除率為83.2%；當茶多酚的濃度≥0.5 mg·mL-1時，對羥基自由基的清除效果較好，最大清除率為88.3%。這說明松茸多糖對羥基自由基的清除作用弱于茶多酚。

2.4 對脂質過氧化的抑制作用

松茸多糖對卵磷脂脂質過氧化的抑制作用見圖3。

圖3 松茸多糖對卵磷脂脂質過氧化的抑制作用

由圖3可知，松茸多糖對卵磷脂脂質過氧化的IC50為0.323 mg·mL-1，茶多酚對卵磷脂脂質過氧化的IC50為0.216 mg·mL-1；當濃度≥0.6 mg·mL-1時，茶多酚和松茸多糖對卵磷脂脂質過氧化的抑制效果較好，最大抑制率分別為67.5%、71.3%。這說明茶多酚在低濃度時對卵磷脂脂質過氧化的抑制作用啟動較快，但松茸多糖對卵磷脂脂質過氧化的最大抑制作用卻比茶多酚稍強，且能持續發揮作用。

3 結論

利用超聲波輔助水提及醇沉法從松茸中提取可溶性多糖,多糖提取率達到5.10%，提取物中多糖含量為54.32%。松茸多糖提取物有較明顯的抗氧化作用，與公認的天然抗氧化劑茶多酚相比，對羥基自由基、超氧陰離子自由基的最大清除作用相近，但松茸多糖提取物對兩種自由基的IC50要高于茶多酚，說明松茸多糖清除作用啟動濃度要高于茶多酚；茶多酚在低濃度時對卵磷脂脂質過氧化的抑制作用啟動較快，但松茸多糖對卵磷脂脂質過氧化的最大抑制作用卻比茶多酚稍強，且能持續發揮作用。

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