PHB產(chǎn)生菌發(fā)酵條件的研究

涂 毅，王瑋玥，張 弘，魏 凱，來晨剛，曹軍衛(wèi)

(武漢東湖學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430212)

由于石化塑料的難降解性，大量廢棄塑料流入自然界，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，而聚-β-羥丁酸(Poly-β-hydroxybutyrate，PHB)是一種在生態(tài)環(huán)境中能被完全降解為水和二氧化碳的生物材料，因此是一種可以替代石化塑料的理想的生物可降解塑料。PHB不僅可以用于輕工、化工、食品、農(nóng)業(yè)等現(xiàn)行的塑料應(yīng)用行業(yè)，還可用于醫(yī)療衛(wèi)生、高新技術(shù)產(chǎn)品研制等領(lǐng)域。

自1926年首次發(fā)現(xiàn)PHB以來，各國學(xué)者對其進(jìn)行了大量的研究，包括產(chǎn)生PHB的微生物，PHB的合成途徑、形成動力學(xué)和機(jī)制，PHB的結(jié)構(gòu)、分子量及生物降解特性等多方面[1,2]。美、德、韓、奧地利等國都已廣泛開展PHB的研究[3,4]。國內(nèi)關(guān)于PHB研究的報道并不太多，上海有機(jī)所、中科院成都生物所、中科院微生物所、山東大學(xué)微生物系偶有PHB研究的信息[5～9]。能合成PHB的微生物分布極廣，包括自養(yǎng)和異養(yǎng)、光能和化能菌等，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)共計65個屬中的多個種，其中既有革蘭氏陰性菌，也有革蘭氏陽性菌[10～15]。

PHB的分子量一般為106Da，熔點為180 ℃，具有高結(jié)晶性、光學(xué)活性和壓電性質(zhì)，是立體規(guī)整的聚合物。如果單體的碳鏈長度增加，其柔韌性將會大大增強(qiáng)，而熔點及結(jié)晶度下降。PHB作為塑料，最好具有60萬Da以上的分子量[16]。

神農(nóng)架林區(qū)是一個有著豐富微生物資源的地區(qū)，本課題組從神農(nóng)架林區(qū)不同地點采集了多份土壤樣本，從中分離得到產(chǎn)生PHB的菌株，并探討了產(chǎn)PHB菌的最佳發(fā)酵條件，從而提高菌株的PHB積累量。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 菌株

從神農(nóng)架林區(qū)采集的土樣中分離得到。

1.1.2 培養(yǎng)基

無氮培養(yǎng)基[17]：葡萄糖10 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.2 g，CaCO35 g，蒸餾水1000 mL，pH值7.0，113 ℃滅菌30 min。

平板培養(yǎng)基[17]：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，酵母膏 3 g，葡萄糖5 g，蒸餾水1000 mL，pH值7.0，121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g·L-1)[14]：酵母膏10，蛋白胨10，牛肉膏5，硫酸銨5，葡萄糖10，pH值7.0。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)[17]：蛋白胨5，酵母膏1，甘油5，葡萄糖5，pH值7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離

將從神農(nóng)架林區(qū)采集的土樣分別標(biāo)記為1#、2#、3#、4#、5#、6#。每份土壤取少量加入50 mL的無菌生理鹽水，混勻，取10 mL上清液接入到無氮液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)48 h。

用10倍稀釋法將上述PHB產(chǎn)生菌富集液稀釋后接種到平板上，于30 ℃培養(yǎng)1～2 d后，挑取單菌落，接種到種子培養(yǎng)基中活化，32 ℃培養(yǎng)24 h后，在235 nm波長處測定其吸收值。然后接種到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，32 ℃搖瓶培養(yǎng)144 h，不同時間取樣，測定生長曲線和PHB產(chǎn)量。

1.2.2 PHB的測定

取發(fā)酵液12 000 r·min-1離心收集細(xì)胞，用氯仿水浴加熱后，離心，取上清液，真空抽干氯仿，白色顆粒即為PHB粗提物。

PHB粗提物中加入10 mL濃硫酸，100 ℃加熱10 min，冷卻后在235 nm波長處測定其吸收值[17]。

1.2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

采用L9(34)正交表，以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)定碳源、氮源、pH值3因素3水平的9種不同配方配制培養(yǎng)基，32 ℃培養(yǎng)6 d，提取PHB后在235 nm波長處測定其吸收值，確定產(chǎn)PHB菌的最適發(fā)酵條件。正交實驗的因素和水平見表1。

表1 正交實驗因素與水平

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離與PHB的測定

按照1.2.1方法，從2#、3#、4#土樣中均分離到了單菌落，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，重新編號為SNJD-3-Ⅰ、SNJD-3-Ⅱ、SNJD-3-Ⅲ。培養(yǎng)后分別提取PHB，在235 nm波長處都有吸收值，證明分離得到的三株菌都是產(chǎn)PHB的菌株。

挑取待測菌株，接種到種子培養(yǎng)基中活化，32 ℃培養(yǎng)24 h后，按照培養(yǎng)基體積5%接種到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，32 ℃搖瓶培養(yǎng)。從第3 d起每天取樣提取PHB，測定OD235值；同時取樣測定560 nm處培養(yǎng)基的吸光值，繪制細(xì)菌生長曲線和PHB產(chǎn)量的進(jìn)程曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 三株菌的PHB產(chǎn)量及其生長曲線

由圖1可知，SNJD-3-Ⅰ和SNJD-3-Ⅱ菌株的PHB產(chǎn)量在培養(yǎng)至第6 d時達(dá)到最大，此時菌株生長進(jìn)入穩(wěn)定期，PHB的積累量達(dá)到最大，第7 d明顯下降。SNJD-3-Ⅲ菌株的生長在第5 d之后進(jìn)入衰亡期，可能由于SNJD-3-Ⅲ菌的穩(wěn)定期很短，不到24 h。而在菌株已經(jīng)進(jìn)入衰亡期后，PHB的積累量還在不斷增加。

2.2 菌種鑒定

取生長比較好的SNJD-3-Ⅰ菌株顯微鏡觀察，革蘭氏染色呈陽性，桿菌，并有芽孢產(chǎn)生，初步鑒定為芽孢桿菌屬。

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

取生長比較好的SNJD-3-Ⅰ菌株進(jìn)一步研究。根據(jù)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基[17]，碳氮比大約為2∶1，因此按比例確定氮源為0.5 g、碳源為1.0 g，定容到50 mL。

正交實驗結(jié)果見表2。

表2 正交實驗結(jié)果

運用SPSS統(tǒng)計分析軟件分析表2數(shù)據(jù)，繪制方差分析表，見表3。

表3 正交實驗的方差分析

由表3可知，碳源、氮源、pH值3個因素中，氮源的P值<0.05，表明氮源的3個水平間有顯著差異，即氮源種類的選擇對實驗結(jié)果有顯著性影響。因此，根據(jù)各因素的最優(yōu)水平，確定SNJD-3-Ⅰ培養(yǎng)的最佳條件是：葡萄糖為碳源，蛋白胨為氮源，pH值為7.0。

在最佳條件下，32 ℃搖床培養(yǎng)6 d后提取PHB，測其OD235值為2.398，大于正交實驗中9個不同培養(yǎng)條件下PHB的OD235值，說明在此最佳培養(yǎng)條件下生長的菌株所積累的PHB的量最多，證明正交實驗所優(yōu)化的結(jié)果確為SNJD-3-Ⅰ的最優(yōu)發(fā)酵條件。

對照PHB標(biāo)準(zhǔn)曲線來判斷PHB含量[18]。根據(jù)測得的最佳培養(yǎng)條件下的PHBOD235值(2.398)， 計算得SNJD-3-Ⅰ菌株所積累的PHB量為14.72 g·L-1。

3 結(jié)論

從神農(nóng)架林區(qū)采集的土樣中分離出了可以在細(xì)胞內(nèi)積累PHB的菌株，分析它們產(chǎn)生PHB的能力，并對其中3個菌株的生長曲線和PHB產(chǎn)量進(jìn)行比較，其中SNJD-3-Ⅰ和SNJD-3-Ⅱ的PHB積累量都在第6 d達(dá)到最大，第7 d明顯下降，而SNJD-3-Ⅲ的PHB產(chǎn)量在生長曲線出現(xiàn)明顯下降后仍呈上升趨勢。對SNJD-3-Ⅰ進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察其為革蘭氏陽性菌，桿菌，并有芽孢產(chǎn)生，初步鑒定為芽孢桿菌屬。通過正交實驗確定了SNJD-3-Ⅰ產(chǎn)PHB的最佳發(fā)酵條件，即以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)、葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源時，控制碳氮比為2∶1，pH值7.0，32 ℃振蕩培養(yǎng)6 d，在該條件下所積累的PHB量為14.72 g·L-1。

[1] 黃海東，王海賓，趙良啟.多聚羥基烷酸的發(fā)酵生產(chǎn)研究進(jìn)展[J].山西化工，2002，22(1):13-15.

[2] 堵國城，陳堅，高海軍，等.真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌積累聚-β-羥基丁酸發(fā)酵條件的研究[J].生物工程學(xué)報，2000，16(1)：21-24.

[3] 許開天，趙樹杰．PHB在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]．應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，1995，1(1)：85-91.

[4] Choi K H,Chisti Y,Moo-Young M.Comparative evaluation of hydrodynamic and gas-liquid mass transfer characteristics in bubble column and airlift slurry reactors[J].The Chemical Engineering Journal and the Biochemical Engineering Journal，1996，62(3)：223-229.

[5] 于慧敏，沈忠耀．可生物降解塑料聚-β-羥基丁酸(PHB)的研究與發(fā)展[J]．精細(xì)與專用化學(xué)品，2001，9(8)：11-14.

[6] 薛林貴，趙旭，景春娥，等.尼羅藍(lán)在篩選PHB高產(chǎn)菌株中的應(yīng)用研究[J].生物技術(shù)通報，2010，(3):181-184.

[7] Low John H，Slepecky Ralph A.Assay of poly-β-hydroxybutyric acid[J].J Bacteriol，1961，82(1)：33-37.

[8] 石海平，蘇濤.微生物發(fā)酵制取聚-β-羥基丁酸研究簡介[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1998，24(2)：79-82.

[9] 易祖華，黃和容，陳琦，等.真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌突變株65-7產(chǎn)聚-β-羥基丁酸的研究[J].微生物學(xué)通報，1995，22(1)：29-31.

[10] Misra A K，Thakur M S，Srinivas P,et al．Screening of poly-β-hydroxybutyrate-producing microorganisms using Fourier transform infrared spectroscopy[J]．Biotech Lett，2000，22(15)：1217-1219.

[11] 陳琦，黃和容，易祖華.微生物合成生物降解塑料研究現(xiàn)狀與展望[J].微生物學(xué)通報，1994，21(5)：297-303.

[12] 洪葵，陳國強(qiáng)，黃為一，等.羥基丁酸及中鏈羥基脂肪酸共聚物的微生物合成[J].微生物學(xué)通報，1994，21(5)：297-303.

[13] 洪葵，陳國強(qiáng)，黃為一，等.羥基丁酸及中鏈羥基脂肪酸共聚物的微生物合成[J].微生物學(xué)通報，1998，25(2)：110-113.

[14] 錢新民，王宇新，常鐘.球形紅桿菌積累β-羥基鏈烷酸(PHA)的研究[J].微生物學(xué)報，1995，35(6)：438-441.

[15] 劉寶全，蔣本國.聚-β-羥基丁酸(PHB)的研究進(jìn)展[J].大連民族學(xué)院學(xué)報,2000，2(4)：56-58.

[16] Steinbuchel A，Valentin Henry E．Diversity of bacterial polyhydroxy-alkanoic acids[J]．FEMS Microbiology Letters，1995，128(3)：219-228．

[17] 陳宏，方東升，陳秉良.聚-β-羥基丁酸產(chǎn)生菌NS-82的研究[J].微生物學(xué)通報，2001，28(4)：72-75.

[18] 陳接鋒，許旭萍，余晨興，等.合成聚-β-羥基丁酸(PHB)鞘細(xì)菌的分離、鑒定與篩選[J].工業(yè)微生物，2003，33(4)：23-31.