大腸桿菌莽草酸生產(chǎn)菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

錢 晉，楊 捷，葉 江，張惠展

(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237)

傳統(tǒng)中藥八角的重要提取物莽草酸，具有鎮(zhèn)定、消炎、抗血栓形成[1]的作用,同時是多種抗癌、抗病毒藥物的合成中間體[2]。莽草酸的分子結(jié)構(gòu)中含有1個六碳環(huán)、3個羥基、1個羧基、1個雙鍵，這樣的結(jié)構(gòu)可以成鹽，也可以成酯。此外還具有3個不對稱中心，如此優(yōu)良的手性結(jié)構(gòu)可以作為一個應(yīng)用面很廣的生物合成重要化合物的光學(xué)純骨架[3]。近年來，專家發(fā)現(xiàn)莽草酸在超臨界水中可以反應(yīng)生成苯酚，提供了一條從可更新原料生產(chǎn)苯酚的新路線[4]。另外，莽草酸還可以用作食品添加劑[5]。而莽草酸最受關(guān)注的是其作為關(guān)鍵起始材料合成神經(jīng)氨酸酶抑制劑GS4104，進(jìn)而合成得到防治禽流感的特效藥達(dá)菲[6]。

為了研究莽草酸代謝途徑中各個基因?qū)τ诿Р菟岱e累的作用，本實驗室在前期構(gòu)建了含有不同單基因或多基因串聯(lián)表達(dá)盒的大腸桿菌莽草酸生產(chǎn)菌株，并嘗試通過測量培養(yǎng)基中莽草酸的積累量來對各基因的作用進(jìn)行考量。然而菌體培養(yǎng)過程和測量過程均會引入不同程度的誤差，為了降低這些過程所引入的誤差從而提高實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，在此對各個莽草酸生產(chǎn)菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并對培養(yǎng)過程和測量方法進(jìn)行考察，為后續(xù)深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 菌株、重組質(zhì)粒與培養(yǎng)基

菌株JM83[F-araΔ(lac-proAB)rpsL(Strr)φ80ΔlacZΔM15],自行保藏；JDL02(The same as JM83，but ΔaroL)，楊捷碩士構(gòu)建。

重組質(zhì)粒pTrc-aroG、pTrc-ppsA、pTrc-aroG-tktA、pTrc-ppsA-aroG、pTrc-ppsA-aroG-tktA均由楊捷碩士構(gòu)建，其載體均為pTrc99a，重組基因分別為aroG、ppsA、aroG-tktA、ppsA-aroG、ppsA-aroG-tktA。

LB培養(yǎng)基：氯化鈉1.0%、酵母提取物 0.5%、胰蛋白胨1.0%、瓊脂 1.8%(配制固體培養(yǎng)基時添加)。

M9培養(yǎng)基：5×M9鹽溶液(64 g·L-1Na2HPO4·7H2O、15 g·L-1KH2PO4、2.5 g·L-1NaCl、5.0 g·L-1NH4Cl)20%，1 mol·L-1CaCl20.01%，25%葡萄糖 4%，1 mol·L-1MgSO40.002%(在培養(yǎng)前加入已消毒的葡萄糖和1 mol·L-1MgSO4)。

1.2 試劑與儀器

氨芐西林鈉(Ampicillin，Ap)，上海新先鋒藥業(yè)有限公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，Promega；莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品，上海自杰生化科技有限公司；瓊脂糖(Agarose)，上海賽百盛基因技術(shù)有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

Gilson型精細(xì)移液器，法國；SORVALL SUPER T21型高速冷凍離心機，美國；TL-18M型臺式高速冷凍離心機、SCS-24型搖床，上海離心機械研究所；CA-1390-1型循環(huán)氣流垂直潔凈工作臺，上海上凈凈化設(shè)備有限公司；YXQ-LS-SⅡ型全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UV-7504型單光束紫外可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)條件

將大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)12～16 h，或者劃線擴增在LB固體培養(yǎng)基平板上，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16 h。對于胞內(nèi)含有表達(dá)氨芐青霉素抗性基因(Apr)的質(zhì)粒(如pTrc-99a)的大腸桿菌，需要在培養(yǎng)環(huán)境中額外加入氨芐西林鈉(終濃度100 μg·mL-1)。對于要用Trc啟動子誘導(dǎo)表達(dá)蛋白產(chǎn)物的情況，則向培養(yǎng)環(huán)境中添加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(終濃度50 μg·mL-1)作為誘導(dǎo)劑。

1.3.2 菌株的保藏

LB-甘油保藏法：將1.5 mL培養(yǎng)液于常溫8000 r·min-1離心2 min，棄上清，打散菌體。之后各取無菌LB液體培養(yǎng)基和甘油300 μL加至含有打散菌體的Eppendorf管中，用漩渦振蕩器振勻，置于-20 ℃或-80 ℃冰箱；或者先取600 μL無菌LB液體培養(yǎng)基—甘油(1∶1)混合液于Eppendorf管中，再用無菌牙簽從固體培養(yǎng)物上挑取目的菌落于管中，然后旋轉(zhuǎn)牙簽使其均勻懸浮于保藏液中，置于-20 ℃或-80 ℃冰箱。此法保藏的菌株活性可維持?jǐn)?shù)年，但需要每隔一段時間取出振蕩一下，防止由于甘油沉入管底而導(dǎo)致菌株失活。

1.3.3 莽草酸的檢測[7]

用牙簽從甘油保藏管中蘸取少量大腸桿菌接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)12～16 h。次日取適量菌液用最小培養(yǎng)基M9培養(yǎng)基洗滌，接種于25 mL M9液體培養(yǎng)基中并添加相應(yīng)的抗生素，于37 ℃搖床培養(yǎng)48 h，之后吸取適量菌液至Eppendorf管中，于室溫15 000 r·min-1離心15 min，取上清。吸取適量上清加入250 μL高碘酸鹽試劑，用M9培養(yǎng)基補足反應(yīng)體系至500 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱保溫0.5 h后加入NaOH-Na2SO3混合溶液終止反應(yīng)。于382 nm處測吸光度OD382。

2 結(jié)果與討論

2.1 高碘酸顯色法的誤差分析

用莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品配制0.04 mg·mL-1莽草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，取250 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液(相當(dāng)于10 μg莽草酸)，加入250 μL高碘酸鹽溶液，置于37 ℃培養(yǎng)箱保溫0.5 h后加入500 μL NaOH-Na2SO3混合溶液，測OD382值，做5管(A～E)平行管。結(jié)果十分接近，依次為2.624、2.623、2.624、2.624、2.624，由此可以確定顯色實驗本身是非常穩(wěn)定的。

2.2 不同批次操作之間的誤差分析

取250 μL 0.04 mg·mL-1莽草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用高碘酸顯色法測OD382值，每隔2 d重復(fù)1次，共做5次，結(jié)果依次為2.630、2.625、2.633、2.623、2.624，極差相對值為0.04。表明不同批次的實驗操作所引入的誤差是在允許范圍內(nèi)的。

2.3 莽草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制0.1 mg·mL-1莽草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取0 μL、 20 μL、40 μL、80 μL、100 μL、150 μL的莽草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用ddH2O補足到250 μL，隨后加入250 μL高碘酸鹽溶液，置于37 ℃培養(yǎng)箱保溫0.5 h后加入500 μL NaOH-Na2SO3混合溶液，測OD382值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 莽草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 培養(yǎng)環(huán)境的檢驗

實驗所用SCS-24型搖床的平面示意圖，見圖2。

圖2 搖床平面示意圖

在搖床上挑選16個位置(編號1～16)進(jìn)行培養(yǎng)環(huán)境的實驗。從大腸桿菌JM83的單克隆板上挑取單克隆接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)過夜，次日分別取相同菌體量接種于16份添加了脯氨酸和酪蛋白水解物的25 mL M9培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱的相應(yīng)位置，于37 ℃培養(yǎng)48 h。最后測菌密度OD600。此實驗每隔一周重復(fù)一次，共重復(fù)3次，結(jié)果見表1。

表1 不同培養(yǎng)位置的菌密度OD600

從表1可以看出，在培養(yǎng)箱中不同位置培養(yǎng)的菌體的生長狀況存在較大的差異。這可能是由于不同的培養(yǎng)位置距離出風(fēng)口的距離不同，因此各個位置的局部環(huán)境溫度有所差異，從而導(dǎo)致不同位置菌體的生長產(chǎn)生了差別。而3次實驗之間數(shù)值也有差異，這可能是由于翻瓶時的菌液加入量有少許差異以及不同培養(yǎng)周期環(huán)境溫度差異的共同影響。根據(jù)位置1和2的數(shù)值，可知風(fēng)口右端位置的菌體生長狀況較差；根據(jù)位置2與3的數(shù)值，可以推斷搖床最上面一排位置培養(yǎng)的菌體生長狀況較差；比較位置10、15、16的數(shù)值，可知斜面方向上離風(fēng)口越遠(yuǎn)菌體生長狀況越好。為了提高實驗的準(zhǔn)確性，盡量選取培養(yǎng)條件差不多的位置進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.5 誘導(dǎo)時間的優(yōu)化

由于培養(yǎng)工程菌使用的是最小培養(yǎng)基M9培養(yǎng)基，因此菌體生長速度較之用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)時要慢許多。在這種情況下就不能按照原來的誘導(dǎo)時間進(jìn)行誘導(dǎo)，這是因為，如果添加IPTG過早就會影響到菌體的生長狀況；而添加過晚就會影響產(chǎn)量，因此，需要重新確定合適的IPTG誘導(dǎo)時間。

選擇pTrc-aroG-tktA/JDL02作為測試菌株，從甘油保藏管中蘸取少許菌體接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)過夜，次日按照1%接種量吸取培養(yǎng)菌液接種于添加了脯氨酸和酪蛋白水解物的300 mL M9培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)。分別于3.0 h、3.5 h、4.5 h、5.5 h、6.5 h、7.5 h、8.5 h、9.5 h、10.5 h、11.5 h、12.5 h取出部分菌液測菌密度OD600，同時從母瓶中取出25 mL培養(yǎng)液加入到已消毒的250 mL搖瓶中并加入終濃度為0.167 mg·mL-1的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，隨后繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)48 h后取出部分菌液測菌密度OD600，剩余菌液繼續(xù)培養(yǎng)；誘導(dǎo)48 h后取出部分菌液測菌密度OD600，并將剩余菌液15 000 r·min-1離心15 min，取適量上清，測莽草酸含量。不同誘導(dǎo)時間下誘導(dǎo)時、培養(yǎng)48 h、誘導(dǎo)48 h的菌密度OD600見圖3，不同誘導(dǎo)時間的莽草酸產(chǎn)量見圖4。

圖3 不同誘導(dǎo)時間的菌密度

圖4 不同誘導(dǎo)時間的莽草酸產(chǎn)量

從圖3可以看出，如果按照實驗室LB培養(yǎng)時常用的當(dāng)菌體生長到OD600為0.6時進(jìn)行誘導(dǎo)，將會影響到菌體的正常生長，導(dǎo)致菌體在培養(yǎng)48 h后菌密度OD600只有1.0左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常的3.5；在6.5 h之前進(jìn)行誘導(dǎo)都會對菌體的生長產(chǎn)生一定的影響；而在6.5～12.5 h進(jìn)行誘導(dǎo)都不會對菌體生長產(chǎn)生影響。

從圖4可以看出，雖然6.5 h之后誘導(dǎo)對于菌體生長不會有影響，但是過晚誘導(dǎo)還是會對莽草酸的產(chǎn)量產(chǎn)生影響，莽草酸產(chǎn)量的最高值出現(xiàn)在7.5 h時誘導(dǎo)的樣品。綜合菌體生長情況和莽草酸產(chǎn)量，確定合適的誘導(dǎo)時間是在培養(yǎng)7.5 h左右。

2.6 莽草酸生產(chǎn)菌株的產(chǎn)量測定

在確定了高碘酸顯色法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性并優(yōu)化了搖瓶培養(yǎng)條件之后，對實驗室現(xiàn)有的一系列莽草酸生產(chǎn)菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)并測定其莽草酸的產(chǎn)量。分別在5 mL LB液體培養(yǎng)基中接種JM83、JDL02、pTrc-aroG/JDL02(A/02)、pTrc-ppsA/JDL02(P/02)、pTrc-aroG-tktA/JDL02(AT/02)、pTrc-ppsA-aroG/JDL02(PA/02)、pTrc-ppsA-aroG-tktA/JDL02(PAT/02)菌株，置于37 ℃搖床培養(yǎng)過夜。次日吸取相同菌體量的菌液分別接種于25 mL添加了脯氨酸和酪蛋白水解物的液體M9培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)7.5 h時分別添加終濃度為0.167 mg·mL-1的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，將菌液15 000 r·min-1離心15 min，取適量上清測莽草酸產(chǎn)量，結(jié)果見表2。

表2 各工程菌莽草酸產(chǎn)量/mg·L-1

從表2可以看出，pTrc-ppsA-aroG-tktA/JDL(PAT/02)的莽草酸產(chǎn)量比其它單基因表達(dá)菌株的產(chǎn)量要低，與楊捷等[8]實驗結(jié)論相同。在優(yōu)化了包括培養(yǎng)位置、誘導(dǎo)時間在內(nèi)的搖瓶培養(yǎng)條件之后，搖瓶培養(yǎng)pTrc-aroG-tktA/JDL02(AT/02)的莽草酸產(chǎn)量提高到了224.324 mg·L-1，比原來搖瓶發(fā)酵的94.33 mg·L-1提高了2.38倍。

3 結(jié)論

為了降低實驗培養(yǎng)環(huán)節(jié)所引入的誤差，對前期構(gòu)建的一系列莽草酸生產(chǎn)菌株進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化。研究表明，高碘酸顯色法本身以及不同批次操作所引入的誤差是可以忽略的，然而菌體生長環(huán)境的不同將會導(dǎo)致菌株的生長狀況不同。優(yōu)化了莽草酸工程菌搖瓶培養(yǎng)的位置以及誘導(dǎo)時間(7.5 h)后，pTrc-aroG-tktA/JDL02的莽草酸搖瓶產(chǎn)量由原來的94.33 mg·L-1提高到224.324 mg·L-1。

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