重組豬源抗菌肽Cecropin P1在畢赤酵母中的分泌表達與活性研究

陳婉嫻，翟李鵬，葉 江，張惠展

(華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237)

抗菌肽(Cecropin)是一類被稱為“第二防御體系”的生物活性小肽[1]，具有廣譜、高效的抑菌活性，能攻擊癌細胞而不破壞正常細胞，還能促進傷口愈合[2]，可開發成具有一定應用價值的食品添加劑和藥物。

豬源抗菌肽Cecropin P1[3]含有31個氨基酸殘基，分子量為3337.87 Da，不含半胱氨酸，不形成分子內二硫鍵，有強堿性的N-端和強疏水性的C-端，C-端酰胺化。其分子內含有兩親性α-螺旋，中間是形成柔性彎曲的谷氨酸-甘氨酸(Glu-Gly)卷曲序列[4]，這一特征結構對其保持高抗菌活性具有特殊的重要性。

原核表達系統所表達的外源蛋白難以進行翻譯后的修飾加工，且融合表達的后處理麻煩，不適宜大規模生產；而畢赤酵母表達系統不僅能使外源真核基因正確翻譯和翻譯后加工，而且能分泌許多蛋白質產物，使產物易于提純[5]，同時由于其表達水平高、操作簡單、成本低廉，更適合于小分子抗菌多肽生產工藝的研發[6]。因此，作者選擇畢赤酵母(Pichiapastoris)作為表達系統，以分泌型穿梭質粒pPICZαB和pGAPZαA為載體，旨在構建高效表達活性重組抗菌肽Cecropin P1的酵母基因工程菌。

1 實驗

1.1 菌株、質粒與培養基

大腸桿菌(Escherichiacoli)TOP10、指示菌ATCC25922標準株，自行保存；PichiapastorisX-33、真核表達載體pPICZαB和pGAPZαA，美國Invitrogen公司。

YPD培養基(山梨醇選擇培養基)：2% Polypeptone，1% Yeast extract,2% D-葡萄糖。

BMGY培養基:2% Polypeptone，1% Yeast extract，1.34% YNB,4×10-5%生物素，0.5%甘油，100 mmol·L-1磷酸鉀緩沖溶液(pH值6.0)。

BMMY培養基:2% Polypeptone，1% Yeast extract，1.34% YNB,4×10-5%生物素，0.5%甲醇，100 mmol·L-1磷酸鉀緩沖溶液(pH值6.0)。

MD培養基：1.34% YNB，4×10-5%生物素，2%葡萄糖，1.5% Agar,ddH2O。

MM培養基：1.34% YNB，4×10-5%生物素，0.5%甲醇，1.5% Agar,ddH2O。

1.2 試劑

限制性內切酶HindⅢ、NcoⅠ、SacⅠ、AvrⅡ、低分子量Protein Marker，TaKaRa公司；超低分子量Protein Marker，Bio-Rad公司；Polypeptone、Yeast extract、YNB、山梨醇、生物素，OXIOD公司；博萊霉素(ZeocinTM)，Invivogen公司；質粒小量抽提Kit，上海捷瑞生物科技有限公司；其余試劑均為國產或進口分析純。

1.3 方法

1.3.1 分泌表達載體的構建

根據已發表的Cecropin P1氨基酸序列，選用畢赤酵母偏好性密碼子設計編碼基因，并在其兩端添加表達載體的同源序列，利用重疊區基因擴增拼接法(SOE-PCR)合成目的片段后，通過Fast seamless cloning重組技術[7]，分別在大腸桿菌TOP10中構建得到以pPICZαB/pGAPZαA為載體的Cecropin P1基因C-端干凈以及C-端融合6xHis-Tag的不同表達盒。重組質粒經酶切和PCR鑒定，并對其測序。

1.3.2 重組質粒轉化畢赤酵母及表型篩選

將畢赤酵母菌X-33制備成感受態。取1～10 μg的SacⅠ或AvrⅡ線性化的重組質粒，分別與100 μL酵母感受態細胞混合，在1.5 kV、25 μF、200 Ω條件下電擊轉化，然后立即加入1 mL預冷的1 mol·L-1山梨醇，30 ℃溫育1～2 h，取100 μL涂布于含不同濃度博萊霉素的YPD平板上，于30 ℃倒置培養3～6 d，直到長出菌落，篩選出高拷貝轉化子。由于pPICZαB為甲醇利用型質粒，整合到酵母基因組后的表達需PAOX1介導，因此需篩選出甲醇利用正常型轉化子Mut+。而pGAPZαA為組成型質粒，無需此步驟。挑取pPICZαB重組菌落劃線于MM和MD選擇培養基平板上，于30 ℃培養2～3 d，通過觀察生長速度鑒定其表型。pPICZαB重組質粒在MM和MD兩種平板中都能生長的為Mut+型轉化子；而在MD中生長正常、在MM中不能生長或生長緩慢的為Muts型轉化子。

1.3.3 酵母轉化子的PCR鑒定

將篩選得到的轉化子接種到5 mL的YPD培養基中，30 ℃過夜培養，取1.5 mL菌液抽提染色體基因組[8]，稀釋500倍后作為模板，以通用引物5′AOX1和3′AOX1擴增AOX1基因，同時用Cecropin P1上下游引物進行鑒定。

1.3.4 陽性菌株的誘導表達

挑取經 PCR鑒定為陽性的Mut+表型高拷貝轉化子于25 mL的BMGY培養基中，30 ℃、250 r·min-1培養至OD600為5，8000 r·min-1離心10 min，收集菌體，棄上清，將菌體重懸于BMMY培養基中，使其OD600為1，然后繼續在30 ℃搖床培養，每隔24 h向BMMY培養基中加入甲醇至終濃度為0.5%，并按照24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、120 h時間點嚴格取樣1 mL，取上清于-80 ℃保存；對于pGAPZαA構建所得的陽性轉化子，則接種到15 mL的YPD培養基中，30 ℃、250 r·min-1搖床培養過夜，取0.2 mL培養液接種于100 mL YPD培養基中，繼續在30 ℃搖床培養，同樣按照以上時間點取樣。

所得發酵液上清用DOC-TCA法[9]進行沉淀，待樣品大約濃縮66倍之后，以Tricine-SDS-PAGE檢測蛋白表達情況[10]。

1.3.5 重組蛋白的純化以及蛋白含量測定

采用鎳柱親和層析法[11]對重組蛋白進行純化，Bradford法[11]檢測蛋白總含量。

1.3.6 生物活性檢測

用薄層平皿瓊脂糖孔穴擴散法[12]對純化的重組蛋白進行抑菌活性鑒定，指示菌為ATCC25922。

2 結果與討論

2.1 分泌表達載體的構建

構建的分泌表達載體pPICZαB-Cecropin P1和pGAPZαA-Cecropin P1如圖1所示。

圖1 重組表達載體pPICZαB-Cecropin P1和pGAPZαA-Cecropin P1的構建

用HindⅢ和NcoⅠ雙酶切pPICZαB-Cecropin P1以及pGAPZαA-Cecropin P1進行鑒定，得到預期相應片段,見圖2。采用Cecropin P1基因內部的正向引物和載體上的反向引物3′AOX1進行PCR鑒定，結果見圖3。同時經過序列測定得到正確的重組質粒。

M.Marker 1.Negative control digested with Hin dⅢ and Nco Ⅰ 2.pPICZαB-Cecropin P1/pGAPZαA-Cecropin P1 digested with Hin dⅢ and Nco Ⅰ

M.Marker 1.Negative control 2.Positive control 3～7.pPICZαB-Cecropin P1/pGAPZαA-Cecropin P1

將所得到的4個重組質粒分別命名如下：

C-端干凈：pPICZαB-Cecropin P1-1和pGAPZαA-Cecropin P1-1；

C-端融合6xHis-Tag：pPICZαB-Cecropin P1-2和pGAPZαA-Cecropin P1-2。

2.2 重組質粒轉化X-33及表型篩選

電轉前首先用SacⅠ消化pPICZαB-Cecropin P1-1和pPICZαB-Cecropin P1-2，用AvrⅡ處理pGAPZαA-Cecropin P1-1和pGAPZαA-Cecropin P1-2，制備高濃度的線性化質粒后，電轉畢赤酵母X-33的感受態細胞得到高拷貝轉化子。表型篩選結果顯示，篩選的30個轉化子中有26個為Mut+型整合子，占總數的86.7%。

2.3 轉化子的PCR鑒定

將篩選正確的高拷貝整合子抽提出染色體基因組后進行PCR鑒定，結果與預期相符(圖4)。

M.Marker 1.Positive control(5′AOX1+3′AOX1) 2.Negative control 1(5′AOX1+3′AOX1) 3.Negative control 2(5′AOX1+3′AOX1)4/5.PCR analysis of pPICZαB-Cecropin P1-1/2 and pGAPZαA-Cecropin P1-1/2 (5′AOX1+3′AOX1) 6.Positive control(upstream+downstream primer) 7.Negative control 1(upstream+downstream primer) 8.Negative control 2(upstream+downstream primer) 9/10.PCR analysis of pPICZαB-Cecropin P1-1/2 and pGAPZαA-Cecropin P1-1/2 (upstream+downstream primer)

2.4 重組蛋白的表達及產物鑒定

將重組酵母細胞的發酵液上清濃縮樣品進行Tricine-SDS-PAGE后發現，pPICZαB-Cecropin P1-1/X-33、pPICZαB-Cecropin P1-2/X-33、pGAPZαA-Cecropin P1-1/X-33、pGAPZαA-Cecropin P1-2/X-33分別在36 h、48 h、36 h、72 h達到重組蛋白的最佳收獲時間，而通過Bandscan軟件分析蛋白電泳圖譜后發現，各最佳時間點表達的重組蛋白分別占總蛋白含量的66.6%、84.9%、59.8%、10.1%(圖5)。

圖5 pPICZαB-Cecropin P1-1/X-33(a)、pPICZαB-Cecropin P1-2/X-33(b)、pGAPZαA-Cecropin P1-1/X-33(c)和pGAPZαA-Cecropin P1-2/X-33(d)的表達

2.5 重組蛋白的分離純化以及蛋白含量測定

分別收集4種重組酵母細胞在最佳收獲時間的發酵液上清。對于C-端干凈的重組蛋白，經PEG法初步濃縮，超濾離心純化，然后用Bradford法測總蛋白含量，結合重組蛋白占總蛋白的百分比，測得蛋白濃縮液的濃度分別為512 mg·L-1以及528 mg·L-1，又由于收集的發酵液上清為30 mL，則計算得到pPICZαB-Cecropin P1-1/X-33和pGAPZαA-Cecropin P1-1/X-33的發酵液上清中Cecropin P1濃度分別為8.53 mg·L-1和8.80 mg·L-1；對于C-端融合6xHis-Tag的重組蛋白，首先經過鎳柱親和層析純化后，收集最佳洗脫條件的洗脫液，同樣經初步濃縮和超濾純化，用Bradford法測得蛋白濃縮液的濃度分別為209 mg·L-1以及57 mg·L-1，結合發酵液上清的體積計算得到pPICZαB-Cecropin P1-2/X-33和pGAPZαA-Cecropin P1-2/X-33的發酵液上清中Cecropin P1濃度分別為3.48 mg·L-1和0.95 mg·L-1。

2.6 重組蛋白抑菌活性檢測

pPICZαB-Cecropin P1-1/X-33、pPICZαB-Cecropin P1-2/X-33、pGAPZαA-Cecropin P1-1/X-33和pGAPZαA-Cecropin P1-2/X-33濃縮液的蛋白含量分別為512 mg·L-1、209 mg·L-1、528 mg·L-1以及57 mg·L-1，可換算成0.154 mmol·L-1、0.062 mmol·L-1、0.159 mmol·L-1和0.017 mmol·L-1。

分別取等摩爾量的pPICZαB-Cecropin P1-1/X-33和pPICZαB-Cecropin P1-2/X-33、pGAPZαA-Cecropin P1-1/X-33和pGAPZαA-Cecropin P1-2/X-33的重組蛋白濃縮液，檢測其對大腸桿菌的抑制活性，結果如圖6所示。

(a)pPICZαB-Cecropin P1-1/X-33和pPICZαB-Cecropin P1-2/X-33 (b)pGAPZαA-Cecropin P1-1/X-33和pGAPZαA-Cecropin P1-2/X-331.Negative system control 2.Positive control(9 mm) 3.Cecropin P1 from pPICZαB-Cecropin P1-1/X-33 4.Cecropin P1 from pPICZαB-Cecropin P1-2/X-33 5.Negative control Ap.Positive system control(13.5 mm)1′.Negative system control 2′.Positive control(8.5 mm) 3′.Cecropin P1 from pGAPZαA-Cecropin P1-1/X-33 4′.Cecropin P1 from pGAPZαA-Cecropin P1-2/X-33 5′.Negative control Ap′.Positive system control(12 mm)

由圖6a可見，pPICZαB-Cecropin P1-1/X-33蛋白濃縮液的抑菌圈直徑為8.0 mm，而pPICZαB-Cecropin P1-2/X-33的蛋白濃縮液無抑菌現象出現。樣品陽性對照為等摩爾量的化學合成標準品Cecropin P1，其抑菌圈大小為9 mm。由圖6b可見，pGAPZαA-Cecropin P1-1/X-33的抑菌圈直徑為8.1 mm，而pGAPZαA-Cecropin P1-2/X-33沒有顯示出抑菌活性。樣品陽性對照為等摩爾量的化學合成標準品Cecropin P1，其抑菌圈大小為8.5 mm。這表明，C-端干凈的Cecropin P1具有抑菌活性，而C-端融合6xHis-Tag純化標簽的Cecropin P1不具有抑菌活性，這可能是由于Cecropin P1為小分子多肽，末端帶有的標簽蛋白影響了其蛋白質結構，使之無法正確折疊，從而喪失活性功能。因而也證明了Cecropin P1的C-端序列對其功能具有重要影響。

3 結論

依據畢赤酵母的密碼子偏愛性，采用重疊區基因擴增拼接法按照Cecropin P1的氨基酸序列設計合成其編碼基因。為實現Cecropin P1在畢赤酵母中的高效、活性表達，設計了兩個C-端序列不同的表達盒：一是末端添加終止密碼子，二是融合了六聚組氨酸標簽序列。利用同源重組技術，以穿梭質粒pPICZαB與pGAPZαA為載體，分別構建得到pPICZαB-Cecropin P1-1、pPICZαB-Cecropin P1-2、pGAPZαA-Cecropin P1-1和pGAPZαA-Cecropin P1-2四個表達質粒，經電轉整合至畢赤酵母基因組DNA上，通過拷貝數和表型篩選，得到了畢赤酵母整合子pPICZαB-Cecropin P1-1/X-33、pPICZαB-Cecropin P1-2/X-33、pGAPZαA-Cecropin P1-1/X-33和pGAPZαA-Cecropin P1-2/X-33。搖瓶發酵結果顯示，最佳收獲時間分別為36 h、48 h、36 h和72 h，重組抗菌肽產量分別為8.53 mg·L-1、3.48 mg·L-1、8.80 mg·L-1以及0.95 mg·L-1，表明pGAPZαA-Cecropin P1-1/X-33的表達量最高。

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