放線菌612243產除草活性代謝產物的研究

宗志友，周 瑜，徐文平，陶黎明

(1.上海師范大學生命與環境科學學院，上海 200234；2.華東理工大學藥學院，上海 200237)

近年來，生物農藥因其具有能克服化學農藥對生態環境的污染和減少在農副產品中的農藥殘留量等優勢，在病蟲害綜合防治中的作用愈來愈重要，地位也愈來愈凸顯，其中微生物農藥是生物農藥最重要的組成部分。

微生物農藥主要包括活體微生物農藥和農用抗生素兩大部分[1]。農用抗生素是在醫用抗生素的應用基礎上發展起來的，最早人們嘗試用醫用土霉素、鏈霉素防治某些果樹、蔬菜上的病害，收到意想不到的效果，由此引發了農用抗生素的研究，距今不過幾十年的歷史。日本的農用抗生素研究發展最快，居于世界領先地位，先后開發出了春日霉素、滅瘟素、多氧霉素、有效霉素、滅孢素等[3]。世界上許多國家如美、日、意、俄、丹麥、印度等已將農用抗生素的研究列入國家發展的重點規劃中。近年來，我國也將生物農藥列入國家重點發展規劃，取得了很大的成績，生物農藥的生產企業也達到一定的規模[4]。

作者在農用抗生素篩選的過程中，發現一株放線菌產生的次級代謝產物具有良好的除草活性，為此對這株微生物產生的代謝產物進行了發酵和分離提取純化，獲得了一個除草活性化合物。在此報道了該化合物的結構解析和生物活性研究。

1 實驗

1.1 材料、培養基和儀器

供試菌株612243，由上海南方農藥研究中心分離純化自貴州高原地區的土樣；除草劑篩選靶標均由上海南方農藥研究中心提供。

種子培養基(g·L-1)：葡萄糖5，淀粉5，蛋白胨1，牛肉膏1，酵母膏1，瓊脂粉15，pH值自然。

液體發酵培養基(g·L-1)：花生粉25，葡萄糖20，淀粉10，酵母膏4，氯化鈉1，牛肉膏1，磷酸氫二鉀0.005，pH值7.0～7.2。

Agilent1200MS-LC型液質聯機色譜儀；東芝UV-2501PC型紫外全光譜掃描儀；Bruker Avance 500 MHz型核磁共振儀；氣相色譜/質譜聯用儀(英國質譜公司Micromass GCTTM)；液相色譜/質譜聯用儀(英國質譜公司Micromass LCTTM)等。

1.2 活性產物的分離純化

將培養好的斜面種子接種于已消毒的發酵培養基中，在28 ℃下振蕩培養96 h，得到發酵液30 L。將發酵液于5000 r·min-1離心20 min，將沉淀部分用10 L 80%丙酮浸泡過夜。冷凍離心去除沉淀，將上清液減壓旋轉濃縮去除丙酮，然后與發酵液合并。用2 BV的正丁醇萃取3次，合并正丁醇相濃縮得到油狀物，再用甲醇溶解，過濾去除甲醇不溶物，濃縮去除甲醇，得黃褐色油狀物25 g。經硅膠柱層析分離(以二氯甲烷∶甲醇為40∶1至1∶5的流動相進行梯度洗脫)，根據生物活性跟蹤結果，將活性部分濃縮，得淡黃色粉末狀固體1.1 g。用少量甲醇溶解，進行TLC制備(以甲醇∶二氯甲烷=1∶40為展開劑)，將Rf值為0.35的具有除草活性的條帶刮下，用無水甲醇浸泡2 h，過濾，濾液減壓濃縮至10 mL左右，再用制備型HPLC進一步分離純化(制備柱型號：VP250/21 Nucleosil 100-7 C18，612243-B流動相為甲醇∶水=75∶25，流速16 mL·min-1，檢測波長210 nm)。收集活性單峰，濃縮，得白色粉末狀純品612243-B 25.8 mg，純度為96%，對純品進行結構鑒定。整個分離純化過程以除草活性為生物活性跟蹤。

1.3 生物活性測定

除草活性初篩采用黃瓜、莧菜、油菜、馬唐、小麥和稗草的種子萌發抑制實驗。復篩采用鯉腸、莧菜、小藜、馬唐、狗尾和稗草的盆栽測定。

1.4 結構鑒定

將HPLC制備的活性組分612243-B溶解于0.5 mL CDCl3中，分別進行核磁共振掃描。記錄1HNMR、13CNMR、DEPT90、DEPT135、COSY、NOESY、HMQC和HMBC等譜圖信息。

2 結果與討論

2.1 化合物612243-B結構的確定

根據612243-B電噴霧質譜圖(ESI)，可知612243-B[M+K+]=616、[M+Na+]=600、[M+H+]=578，計算出該物質的分子量M=577。根據氮元素規則，分子中應該含有奇數個氮原子。該化合物的相關核磁數據見表1和表2。

表1 化合物612243-B的δC及其HMQC相關的δH

表2 化合物612243-B的1H-1H COSY和13C-1H HMBC信息/ppm

由表1、表2的數據可以確定化合物612243-B具有1個含4個雙鍵的17個C的長鏈，1位C上有1個多位取代的吡啶基團，10位C上有1個葡萄糖基團，具體結構見圖1。

圖1 化合物612243-B的結構式

查閱文獻[4，5]，確認化合物612243-B為葡糖基殺粉蝶菌素(Glucopiericidin A)，分子式為C31H47NO9。

2.2 化合物612243-B生物活性分析

由于葡糖基殺粉蝶菌素是已知的殺蟲活性物質，未見文獻報道其除草活性，為此進行了化合物612243-B的除草活性研究。離體除草活性生測采用杯碟法。具體生物活性見表3～表5。

表3 化合物612243-B的除草活性

表4 化合物612243-B莖葉處理鮮重防效結果

表5 化合物612243-B土壤處理結果

2.3 討論

經文獻查閱，未發現Glucopiericidin A具有除草活性的報道。用化合物Glucopiericidin A對不同植物進行莖葉處理時，該藥劑最佳起效時間為3 d左右，以后藥物可能被分解，植株主要表現為發黃、矮化、生長較弱，且受濃度影響。化合物612243-B施藥20 d后，未死植株長勢慢慢恢復，比CK小，說明施藥后抑制其生長速度，會使雜草在與正常非靶標植物競爭中失去優勢，營養被作物奪取，達到施藥目的。施藥20 d的鮮重結果發現，612243-B土壤處理靶標均無效果，而觀察莖葉處理后的靶標發現，612243-B對雙子葉靶標的藥效要優于禾本科靶標。可以得出土壤處理的防效遠低于莖葉處理的防效。這一結果可能與土壤吸附性或藥劑傳導性有關。

3 結論

在微生物農藥的篩選過程中，發現編號為612243的放線菌株可產生除草活性物質。根據除草活性跟蹤的結果，將其發酵產物進行溶劑萃取、層析及高效液相色譜制備等一系列的分離純化處理，獲得一個活性化合物612243-B。質譜分析表明，該化合物分子量為577、分子式為C31H47NO9；經其它光譜分析并對照數據庫，確定該化合物與已知的葡糖基殺粉蝶菌素(Glucopiericidin A)相同，但未見文獻報道其除草活性的研究。

[1] 陳軼林，張承來.微生物源活性物質的開發與化學新農藥的創制[J].廣東農業科學，2005，(3)：102-104.

[2] 李勇，楊慧敏.微生物農藥的研究和應用進展[J].貴州農藥科學，2003，31(2)：62-63.

[3] 朱昌雄，宋淵.我國農用抗生素的現狀與發展趨勢探討[J].中國農業科技導報，2006，8(6)：17-19.

[4] Matsumoto M，Mogi Kin-ichi，Nagaoka Katsuhiko，et al. New piericidin glucosides，glucopiericidins A and B[J].The Journal of Antibiotics，1987，40(2)：149-156.

[5] Funayama Shinji, Ishibashi Masami, Anraku Yumi, et al.Novel cytocidal antibiotics，glucopiericidins A1 and A2. Taxonomy，fermentation，isolation，structure elucidation and biological characteristics[J].The Journal of Antibiotics，1989，42(12)：1734-1740.