拮抗油菜菌核病的海洋細菌篩選及其活性物質的分子檢測

林建朋，邵宗澤，陳 莉，孫風芹，張智濤，喻子牛，張吉斌

(1.華中農業大學 農業微生物學國家重點實驗室 微生物農藥國家工程研究中心，湖北 武漢 430070；2.國家海洋局第三海洋研究所 海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建 廈門 361005)

目前農業上對植物病原菌害的生物防治已經取得了一定的進展，但是對于很多的病原菌如油菜菌核、棉花枯萎、小麥紋枯等尚無非常有效的生物防治方法，因此對新型微生物資源和活性物質的尋找迫在眉睫。隨著陸地生物源天然產物資源的逐漸減少，從陸地上發現對這些病原菌有抗菌活性的新型天然產物更加困難，因此科學家們將目光投向了占地球表面積達70%以上的海洋環境，尤其是海洋微生物，期待能從中發現具有新型結構的抗菌化合物[1]。海洋環境與陸地差異很大，高鹽、高壓、低營養、低溫、低光照等極端環境賦予了其微生物種類的多樣性和代謝方式的特異性[2，3]。

海洋微生物活性物質的相關研究從20 世紀60 年代逐步開始，近幾年從海洋微生物中篩選的新型病原微生物拮抗菌及其代謝產物的研究逐年增多，2002 年發表的新型結構的677種海洋活性物質中有約1/5來自海洋微生物[4]。研究人員已從海洋細菌、放線菌和真菌中分離出眾多抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗寄生蟲的微生物及具有新分子結構的先導化合物[5，6]，其中有些已經進入了臨床研究階段，而從海洋微生物中篩選抗重要作物病原菌的拮抗菌的研究仍較少。因此，作者從海洋細菌中篩選對重要作物病原菌有拮抗作用的拮抗菌，對于解決困擾人們的多種重要作物病害問題具有十分重要的意義。

1 實驗

1.1 菌種與指示病原菌

海洋細菌共計1021株，由國家海洋局第三海洋研究所海洋生物遺傳資源重點實驗室和中國海洋微生物菌種保藏管理中心(MCCC)提供。

陽性對照菌株P.fluorescensCHA0、P.fluorescensPf-5、P.fluorescens2-79和P.fluorescensQ8r1-96由美國華盛頓州立大學植物病理系David Weller教授提供。

油菜菌核病病原真菌核盤菌[Sclerotiniasclerotiorum(Lib.) de Bary]，由華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室菌種保藏中心(MGSC)提供。

1.2 培養基

1.2.1 海洋細菌培養基

海水培養基(MB)：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，天然海水(3.4%鹽)1000 mL。

2216E培養基：配方詳見文獻[7]。

MLB培養基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1000 mL。

MHLB培養基：蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，NaCl 30 g，蒸餾水1000 mL。

M2培養基：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，醋酸鈉5 g，天然海水1000 mL，pH值7.5～7.6。

PTA培養基：蛋白胨0.5 g，酵母膏0.5 g，葡萄糖0.2 g，蔗糖0.2 g，硝酸銨2 g，無水乙酸鈉2 g，馬鈴薯浸出粉0.5 g，天然海水1000 mL，pH值7.4～7.5。

2 L培養基：蛋白胨10 g，酵母粉2 g，硝酸銨0.2 g，無水乙酸鈉1 g，檸檬酸三鈉0.5 g，普通肉汁培養基(粉)0.5 g，天然海水1000 mL，pH值7.5～7.6。

1.2.2 植物病原菌培養基

PDA培養基：新鮮去皮土豆200 g，蔗糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL。

1.3 方法

1.3.1 植物病原真菌核盤菌的活化與培養

從4 ℃保藏的試管斜面上取出小塊核盤菌菌絲塊，接于PDA培養基平板中央，置于25 ℃培養1～2 d，連續活化2～3次，待用。

1.3.2 海洋細菌的活化與培養

用滅菌處理過的牙簽從-80 ℃保藏的甘油管中刮取少量所要篩選的海洋細菌冰塊于相應的海洋細菌培養基上，待碎冰融化，水分完全被瓊脂平板吸附后，使用接種環將細菌劃線分離單菌落，置于20～28 ℃不等的培養箱中培養。待單菌落長出后，分別挑取海洋細菌單菌落于相應搖瓶培養基中，分別于20～28 ℃不等溫度搖床培養2～7 d，待用。

1.3.3 抗油菜菌核病海洋細菌的篩選

(1)初篩。采用瓊脂孔擴散法[8]篩選活性菌株。提前將活化好的病原真菌菌塊接于PDA平板中央，在距平板中央病菌塊周圍等距離處打孔，在孔中加入20 μL的待測菌液上清，25 ℃培養1～2 d，觀察結果并測量抑菌圈大小，每組3個重復，取平均值。

(2)復篩。通過初篩測定有活性的菌株，采用平板對峙培養法繼續篩選2～3次，直至最后確定初篩得到菌株的活性。

1.3.4 拮抗假單胞菌活性物質的分子檢測

對篩選得到的部分假單胞菌株進行活性物質的分子檢測，利用如表1中的特異性引物[9～11]對所挑選的19株活性假單胞菌進行PCR擴增，硝吡咯菌素(Pyrrolnitrin，Prn)合成相關基因prnD的引物為PRND1和PRND2，陽性對照為P.fluorescensCHA0和P.fluorescensPf-5；2，4-二乙酰基間苯三酚(2，4-DAPG)合成相關基因phl的引物為PhlD1和PhlD2，陽性對照為P.fluorescensQ8r1-96；吩嗪(Phenazine，PCA))合成相關基因phzl的引物為PHZ1和PHZ2，陽性對照為P.fluorescens2-79；藤黃綠膿菌素(Pyoluteorin，Plt)合成相關基因pltC的引物為PLTC1和PLTC2，陽性對照為P.fluorescensPf-5。具體反應條件如下：采用25 μL體系：模板DNA 1 μL，上下游引物(10 pmol·L-1)各1 μL，2×Taq PCR mastermix(含染料)12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，Tm值退火45 s，72 ℃延伸1 min，計30次循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃ forever。PCR產物直接進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

挑選目的菌株，對PCR產物進行純化，連接T載體，挑選陽性轉化子送至上海英駿生物技術有限公司(Invitrogen)測序。

表1 PCR反應特異性引物序列

2 結果與討論

2.1 抗油菜菌核病的海洋細菌篩選結果

以油菜菌核盤菌為指示菌，總計篩選了1021株海洋來源的細菌菌株，分屬于168個屬，最終篩選得到144株活性菌株，屬于40個屬，占總篩選菌株數的14.1%、總篩選屬數的23.8%。篩選的1021株海洋菌株主要集中在假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonassp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、交替單胞菌屬(Alteromonassp.)、食烷菌屬(Alcanivoraxsp.)、微桿菌屬(Microbacteriumsp.)等，分別占總篩選菌株數的29.6%、7.1%、7.1%、3.9%、3.8%、2.6%(見表2)，另外還包括占總篩選菌株數32.3%的共計330株其它稀有來源的海洋菌屬，如：貝爾曼氏菌屬(Bermanellasp.)、比齊奧氏菌屬(Bizioniasp.)、棲海膽菌屬(Echinicolasp.)、生菌絲菌屬(Myceligeneranssp.)、赫夫勒氏菌(Hoefleasp.)、預研菌屬(Yokenellasp.)、滇微所菌屬(Yimellasp.)、居綠藻菌屬(Ulvibactersp.)、斯塔普氏菌屬(Stappiasp.)、芽孢八疊球菌屬(Sporosarcinasp.)等。

表2 拮抗油菜菌核病病原真菌的海洋細菌

其中篩選得到的活性菌株中包含假單胞菌屬(Pseudomonassp.)共計50株，占總活性菌株數的34.7%；芽孢桿菌屬(Bacillussp.)共計34株，占總活性菌株數的23.6%；科貝特氏菌屬(Cobetiasp.)共計6株，占總活性菌株數的4.2%；鹽單胞菌屬(Halomonassp.)共計5株，占總活性菌株數的3.5%；食烷菌屬(Alcanivoraxsp.)共計4株，占總活性菌株數的2.8%；微桿菌屬(Microbacteriumsp.)共計3株，占總活性菌株數的2.1%；其它屬共計38株，占總活性菌株數的26.4%。

1021株海洋細菌中總計篩選海洋假單胞菌株302株，得到50株活性菌株，活性菌株的比例為16.6%，主要分布在銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、殺香魚假單胞菌(P.plecoglossicida)、摩氏假單胞菌(P.mosselii)、氧化吲哚假單胞菌(P.indoloxydans)、施氏假單胞菌(P.stutzeri)等種中(見表3)，其中尤其以不同來源的銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)菌株中活性菌株幾率最高，總共篩選了13株銅綠假單胞菌，其中12株對油菜菌核病有抑制活性，篩得率高達92.3%，且12株銅綠假單胞菌對油菜菌核病抑制效果顯著，抑菌圈直徑平均在20 mm以上。

表3 拮抗油菜菌核病病原真菌的海洋假單胞菌

2.2 拮抗假單胞菌活性物質產生分析

利用特異性引物對篩選得到的19株活性假單胞菌(表4)進行活性物質的分子檢測，其PCR擴增結果見圖1。

圖1 19株活性假單胞菌產活性物質分子檢測圖

由圖1可知，菌株1A00318和SH-46以及陽性對照P.fluorescensCHA0、P.fluorescensPf-5經硝吡咯菌素合成基因的引物PRND1和PRND2擴增得到了大小約為786 bp的片段；菌株1A06832和SH-46以及陽性對照菌株P.fluorescensCHA0、P.fluorescensQ8r1-96、P.fluorescensPf-5經2，4-DAPG合成基因的引物PhlD1和PhlD2擴增得到了大小約為629 bp的片段；菌株1A04311、1A05429和1A01321以及陽性對照P.fluorescens2-79經吩嗪合成基因的引物PHZ1和PHZ2擴增得到了大小約為1408 bp的片段；菌株1A06832、1A00318和SH-46以及陽性對照P.fluorescensCHA0、P.fluorescensPf-5經藤黃綠膿菌素合成基因的引物PLTC1和PLTC2擴增得到了大小約為438 bp的片段。

表4 19株活性假單胞菌及陽性對照菌株信息

將Pseudomonassp.1A00318和SH-46、對照P.fluorescensPf-5經硝吡咯菌素合成基因擴增獲得的目的片段(如圖2)進行測序分析，證明不是硝吡咯菌素合成基因，表明19株假單胞菌中沒有發現硝吡咯菌素合成基因。

14.P.fluorescens Pf-5 21.1A00318 22.SH-46

3 結論

(1)以油菜核盤菌為病原指示菌，總計篩選了來自168個不同屬的1021株海洋來源細菌菌株，最終得到144株活性菌株，篩得率為14.1%。在篩選菌株超過20株以上的屬中，發現活性菌株篩得率最高的屬分別是芽孢桿菌屬(46.6%)和假單胞菌屬(16.6%)。

(2)通過比較篩選的302株海洋假單胞菌中的50株活性菌株，發現各個種之間差異明顯，其中以不同來源的銅綠假單胞菌活性菌株篩得率和活性最高。

對其中具有較強抗菌活性的19株假單胞菌進行了產活性物質合成基因的分子檢測，結果表明，菌株1A06832和SH-46擴增獲得了2，4-二乙酰基間苯三酚合成基因的目的片段；菌株1A04311、1A05429和1A01321擴增獲得了吩嗪合成基因的目的片段；1A06832、1A00318和SH-46擴增獲得了藤黃綠膿菌素合成基因的目的片段；而硝吡咯菌素合成基因片段沒有獲得。

(致謝：感謝國家自然科學基金資助，感謝國家海洋局第三海洋研究所海洋生物遺傳資源重點實驗室和中國海洋微生物菌種保藏管理中心(MCCC)給予海洋細菌篩選方面的支持和幫助；特別感謝美國華盛頓州立大學Root Disease Research Unit課題組提供本研究所需的陽性對照菌株。)

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